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Biologia Molecolare

Biologia Molecolare. Biologia Molecolare: Paolo Arosio 10 Lezioni: Martedì ore 11-13 Occorre superare il colloquio di Biologia Molecolare per il corso integrato di biochimica. Un test scritto, o discussione orale . Libri. Biologia Molecolare, Weaver RF, McGraw-Hill editore, 88 Euro oppure

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Biologia Molecolare

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Presentation Transcript

  1. Biologia Molecolare Biologia Molecolare: Paolo Arosio 10 Lezioni: Martedì ore 11-13 Occorre superare il colloquio di Biologia Molecolare per il corso integrato di biochimica. Un test scritto, o discussione orale

  2. Libri • Biologia Molecolare, Weaver RF, McGraw-Hill editore, 88 Euro oppure • Biologia molecolare del gene, Watson J.D. e coll. zanichelli ed oppure • Molecular cell Biology, Lodish e coll.

  3. Biologia Molecolare • La biologia molecolare studia le funzioni biologiche a livello molecolare delle macromolecole informazionali • Scopo del corso: studiare le conoscenze delle macromolecole e dei meccanismi molecolari che sono alla base della conservazione, riparazione, duplicazione e trascrizione degli acidi nucleici, della maturazione dei trascritti, degli eventi post trascrizionali nella sintesi delle proteine, e del loro targeting in sistemi procarioti ed eucarioti. Tali conoscenze potranno essere usate in applicazioni biotecnologiche.

  4. In biologia • I meccanismi fondamentali sono estremamente conservati • I particolari individuali sono estremamente vari

  5. Caratteristiche universali • La cellula • L’ereditarietà e depositata sempre nella stessa molecola, DNA • Parte dell’informazione ereditaria è trascritta sempre nella stessa forma, RNA • Le proteine sono catalizzatori e sono tradotte sempre nello stesso modo • Le piccole molecole sono simili (zuccheri, amino acidi, nucleotidi, ATP, etc) • Le cellule sono racchiuse in membrane

  6. procarioti • E. coli (4.639.221 bp, 4300 geni) è il modello dei batteri

  7. eucarioti • Cellule più grandi (10x lineare, 1000x in volume) organizzate con citoscheletro, membrane intracellulari • Possono fagocitare altre cellule- predatori • Hanno genomi ibridi: nucleare, mitocondrio e plastidi • Hanno genomi molto più grandi di quelli dei procarioti. Molti geni regolatori

  8. Modelli Lievito, S. cerevisiae Arabidopsis thaliana Caenorhabditis elegans Drosofila melanogaster Mouse

  9. Le molecole • Carboidrati • lipidi • Proteine • Acidi nucleici

  10. Proteine: Legame peptidico

  11. Alfa elica

  12. beta

  13. Amino acid chemical modifications • Lys: acetylation, methylation • Arg: methylation • Ser and Thr: phosphorylation, acylation, O-linked glycosylation • Tyr; sulfation, phosphorylation, • Cys: acylation • Asn: N-glycosylation

  14. Categories of Covalent Modifications Modifications: Arg: Mono- & Di-methylation Ser: Phosphorylation (H4) Lys: Acetylation Mono-, Di-, & Tri-methylation Ubiquitination Sumoylation Ser/Thr: Phosphorylation

  15. DNA

  16. Le basi Tautomeria delle basi: Ammino –immino Cheto -enolica

  17. Le coppie di basi A:T e G:C hanno lo stesso ingombro trasversale Gli accoppiamenti causano un accoppiamento antiparallelo Stabilizzato da fattori entropici Da impilamento delle basi Da legami H (specificità)  Incompatibilità A:C

  18. Base flipping • Energeticamente facile • Permette l’accesso alle basi per • Metilazione • Rimozione di basi • Verifica complementarietà

  19. Strutture DNA La struttura B è la più comune La A è più compatta e fatta dall’RNA La Z è levogira e fatta a Zig-Zag

  20. Solco maggiore e minore Il solco maggiore offre informazioni: A: accettore legame H D: donatore legame H M: metile H:idrogeno A:T ADAM, T:A MADA G:C AADH, C:G HDAA Solco minore: A:T AHA, G:C ADA

  21. Conformazioni DNA Nella forma Z il DNA è levogiro. Le purine assumono conformazione anti, invece che sin È favorita da alti sali In soluzione il DNA ha 10.5 bp per giro di elica, assume conformazioni lievemente diverse in base alla sequenza, con torsioni delle basi

  22. Caratteristiche del DNA • È una molecola stabile • Le caratteristiche chimiche sono poco influenzate dalla sequenza • In opportune condizioni si replica (clonaggio) • Si ibridizza con altre molecole di DNA complementari (Sonde)

  23. Denaturazione del DNA Bassi sali Alti sali La temperatura di denaturazione del DNA dipende dalla grandezza della molecola, contenuto in GC e dalla forza ionica del tampone. Alti sali diminuiscono la repulsione eletrostatica dei due filamenti.

  24. Topologia del DNA superavvolgimenti Linking number Lk: numero di volte che un filamento deve essere passato attraverso l’altro per separare le due catene Twist number Tw: numero di volte che un filamento gira intorno all’altro Writhe (contorcimento) number Wr: numero di incroci dell’asse longitudinale

  25. Un DNA rilassato è indicato da Lk0. Lk effettivo è uguale al n di bp / 10.5. Per rilassare il DNA superavvolto si può fare un nick (taglio di un filamento) Differenza di linking: DLk = Lk-Lk0 Se esso è negativo l’avvolgimento è negativo. Come è di solito, la separazione dei due filamenti è favorita. Come nei nucleosomi

  26. Topoisomerasi II Taglia due filamentei, è ATP dipendente

  27. Topoisomerasi I Taglia un filamento. La girasi della replicazione del DNA introduce sopravvolgimenti negativi per facilitare replicazione o trascrizione

  28. Decatenazione, districazione, snodamento del DNA DNA con un nick

  29. Topoisomerasi I • Le topoisomerasi usano una tirosina che opera un attacco nucleofilo al DNA. • L’intermedio ha un legame covalente. • Non si ha consumo di energia

  30. Separazione di DNA La migrazione dei topoisomeri dipende dal numero di superavvolgimenti della molecola

  31. Etidio bromuro Il DNA è un colorante per la colorazione del DNA. La sua fluorescenza aumenta quando si intercala al DNA . Causa uno srotolamento. Il DNA circolare superavvolto negativamente viene srotolato, e quello rilassato viene superavvolto positivamente

  32. RNA • Differenze da DNA: • Ribosio • Uracile • Singola elica • Funzioni: • Intermediario: mRNA • Raccordo: tRNA • Regolazione: MicroRNA, siRNA • Enzima: ribosomi etc.

  33. Doppia elica RNA Strutture hairpin, loop, bulge Alcuni loop sono stabili, esempio cUUCGg

  34. strutture RNA Pseudonodi Appaiamenti non Watson-Crick

  35. strutture RNA RNA a doppia elica può fare solo struttura A, per l’ingombro del 2’OH Solco maggiore meno accessibile, quello minore più accessibile Può formare complesse strutture secondarie

  36. Ribozimi La possibilità di fare strutture secondarie e la reattività del 2’OH permettono all’RNA di avere attività enzimatica, generalmente di tagliare RNA RNAsi P, una ribonucleoproteina che processa tRNA Ribonucleoproteine: RNA splicing Ribonucleasi Hammerhead: tratti di RNA che tagliano sequenze contigue

  37. DNA ricombinante e clonaggio • Le tecniche di DNA ricombinante sono state sviluppate negli anni ’70, principalmente dallo studio dei fagi. • Il DNA dei fagi si ricombina con il DNA genomico del batteri.

  38. Ciclo del fago Lambda Siti coesivi Il fago può incorporare geni batterici

  39. FENOMENO DELLA RESTRIZIONE • Alcuni ceppi batterici sono immuni dall’infezione da parte di batteriofagi in quanto contengono enzimi capaci di degradare il DNA fagico (enzimi di restrizione) senza che venga danneggiato il DNA dell’ospite batterico. • Si è scoperto che i batteri modificano il proprio DNA attraverso la metilazione rendendolo così insensibile all’azione degli enzimi di restrizione. • Endonucleasi di restrizione e metilasi di restrizione

  40. Il DNA del fago lambda K non è riconosciuto come estraneo dal ceppo di E. coli K12 perché ha lo stesso schema di modificazione del geneome delle cellule ospiti. Il DNA viene metilato e propagato Il DNA del fago lambda C è riconosciuto come estraneo e tagliato dalle endonucleasi di restrizione

  41. Le endonucleasi di restrizione • Le classi I e III tagliano lontano dal sito riconoscimento e non sono utili • La classe II riconoscono siti specifici e tagliano la loro livello. • Sono omodimeri e tagliano siti palindromici di 4-8 bp • Ne sono stati identificati circa 3000, e circa 240 sono disponibili commercialmente • Hanno il nome dell’organismo da cui sono state isolate (EcoRI, da E. coli ceppo R).

  42. Alcuni producono frammenti con estremità piatte (blunt end) altri con estremità coesive (5’ o 3’ protundenti).

  43. Passaggi per il legame e taglio di un enzima di restrizione. L’enzima fa un legame non specifico, poi scorre o salta fino al sito specifico, accoppiamento e cambiamento conformazionale, e taglio. Non necessita di ATP.

  44. Joining or Ligation

  45. Restriction Map

  46. Membrane hybridization assay Southern blot

  47. Diagnosi di anemia falciforme mediante polimorfismo di lunghezza di frammenti di restrizione (RFLP) e Southern blot

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