Albero filogenetico (ottenuto mediante l’analisi delle sequenze dell’RNA ribosomiale)

1. Esempio di classificazione batterica: Treponema pallidum Albero filogenetico(ottenuto mediante l’analisi delle sequenze dell’RNA ribosomiale) Gli organismi viventi vengono suddivisi in tre linee evolutive (denominate domini). Due domini (batteri e archebatteri) raggruppano i procarioti, uno gli eucarioti. All’interno di ogni dominio si definiscono, in ordine gerarchico, una serie di raggruppamenti stabiliti in base alla comunanza di caratteri genotipici e fenotipici (Phylum, Classe, Ordine, Famiglia, Genere, Specie). Alcune caratteristiche degli archebatteri (es. assenza di peptidoglicano) li pongono come forma di passaggio tra procarioti ed eucarioti.

2. Microbiologia : parte della biologia che si occupa dello studio dei microrganismi ——————————————————————— Misure usate : 1 millimetro (mm) 0.001 m = 10-3 m 1 micromentro (m) 0.000001 m = 10-6 m 1 nanometro (nm) 0.000000001 m = 10-9 m ——————————————————————— Microrganismi : organismi di dimensioni tali da non potere essere visti a occhio nudo. I microrganismi vengono suddivisi in sei gruppi principali: protozoi, funghi e alghe (appartenenti agli eucarioti), batteri e cianobatteri (appartenenti ai procarioti) e virus a struttura “acellulare” Eucarioti = con nucleo e membrana nucleare, architettura cellulare simile a quella degli organismi pluricellulari, di dimensioni comprese fra 2-25 m : Alghe (fotosintetiche) ProtozoiFunghi Procarioti = il materiale genetico non è racchiuso da membrana nucleare. Batteri = unicellulari, di varie forme comprese fra 0,3-2 m. Virus = privi di qualsiasi struttura cellulare, di dimensioni comprese fra i 20-300nm, visibili solo al microscopio elettronico, struttura molto semplice, si possono riprodurre solo all’interno di una cellula. Esistono anche agenti sub-virali come i viroidi (costituiti solo da RNA) e prioni (costituiti solo da proteine)

3. Confronto fra cellula procariotica e eucariotica

4. Confronto tra procarioti ed eucarioti

5. MORFOLOGIA DELLA CELLULA BATTERICA DIMENSIONI: ~ 0.2 - 2 m di larghezza - ~ 2 - 8 m di lunghezza FORME: Cocco, Bacillo, Vibrione, Spirillo, Spirocheta RAGGRUPPAMENTI: Diplococchi, Diplobacilli, Streptococchi, Streptobacilli, Stafilococchi

6. COLORAZIONE DI GRAM In base alla colorazione di Gram i batteri si dividono in due gruppi: Gram+ e Gram-. Al termine della colorazione alcuni batteri risulteranno colorati in violetto (Gram-positivi) ed altri in rosso (Gram-negativi). Lo spesso strato di peptidoglicano dei Gram+ trattiene il cristal-violetto anche dopo la decolorazione con alcool, mentre il decolorante disperde la membrana esterna e rimuove il colorante dal sottile strato di peptidoglicano dei Gram-. La Gram-positività e la Gram-negatività si accompagnano ad una differente architettura molecolare delle strutture cellulari che si riflettono anche nel meccanismo dell’azione patogena

7. Architettura della cellula batterica ► Assenza di compartimenti intracellulari separati da membrana.

8. ► Non c’è nucleo, ma NUCLEOIDE = zona della cellula dove è localizzato il DNA genomico (che contiene tutta l’informazione genetica essenziale per la cellula batterica). Una sola molecola di DNA, bicatenario, circolare, strettamente raggomitolata e direttamente immersa nel citoplasma (lunga circa 1400 µm, 3x109 daltons in E. coli). ► PLASMIDI = piccole molecole di DNA circolare, con replicazione autonoma, presenti nel citoplasma, con geni non essenziali (es. resistenza a farmaci, coinvolti in meccanismi di scambio genetico, produzione di tossine, ecc).

9. Membrana plasmatica • Formata da un doppio strato fosfolipidico, più flessibile della membrana eucariotica perché mancano gli steroli, come il colesterolo. • I fosfolipidi hanno una struttura assimetrica, con una estremità polare (o testa) e una non polare (o coda), per cui sono detti anfipatici. Le estremità polari sono idrofile, mentre quelle non polari sono idrofobiche, si trovano all’interno e tendono ad associarsi fra loro. Vi sono inserite diverse proteine (trasporto di prodotti e nutrienti; enzimi della catena respiratoria; ecc.).

10. Funzioni: √ barriera selettiva: lascia passare per diffusione passiva (gradiente di concentrazione) solo piccole molecole: H2O, O2, CO2, zuccheri semplici, e alcune sostanze liposolubili; √ sistemi di trasporto attivo (trasferimento ad opera di proteine); √ produzione di energia (enzimi che catalizzano reazioni chimiche, es. produzione di ATP); √ processi biosintetici (es. sintesi di peptidoglicano, replicazione). Meccanismi di trasporto dei nutrimenti attraverso la membrana citoplasmatica: A) Diffusione passiva B) Diffusione facilitata C) Trasporto attivo

11. CITOPLASMA = costituenti chimici comuni alle altre cellule (proteine, acidi nucleici, carboidrati, lipidi, ecc). Mancano organuli. Ribosomi 70S (2 subunità, 50S e 30S). A volte presenti inclusioni citoplasmatiche di varia natura (per lo più materiale di riserva, come granuli di glicogeno, amido e polifosfati). Ribosomi procariotici Inclusioni citoplasmatiche

12. La Parete Batterica • E’ un “contenitore” rigido che racchiude la cellula batterica e ne condiziona la forma. • Funzioni più importanti: • Impedire che le cellule batteriche si rompano per effetto della pressione osmotica (maggiore dentro alla cellula che all’esterno). • La maggior parte dei batteri vive in mezzi ipotonici (=la concentrazione dell’acqua è maggiore che all’interno della cellula). L’acqua entrerebbe fino ad uguagliare le concentrazioni interna ed esterna e la cellula si rigonfierebbe e scoppierebbe (“lisi osmotica”). La parete resiste alla pressione dell’acqua ed impedisce il rigonfiamento. • Altre funzioni importanti sono la protezione della membrana plasmatica e dell’ambiente cellulare da molecole idrofobiche o da sostanze dannose (es. tossine citolitiche, DNAsi, Proteasi, Lipasi, ecc.) e la regolazione dell’entrata dei nutrienti.

13. Parete cellulare Il componente fondamentale della parete è un polimero chiamato Peptidoglicano, formato dalla ripetizione di unità strutturali (monomeri). L’unità strutturale è formata da due carboidrati azotati: la N-acetilglucosamina (NAG) e l’acido N-acetilmuramico (NAM). NAG e NAM sono legati fra di loro da un legame , 1-6. Al gruppo carbossilico del NAM è legato un pentapeptide, dove gli ultimi a.a. sono due D-alanine. Una D-alanina viene persa durante la sintesi del peptidoglicano. Nel polimero peptido glicano , il NAM di una unità strutturale è legato alla NAG dell’unità successiva mediante un legame , 1-6. I diversi polimeri lineari di peptidoglicano sono collegati tra loro mediante legami peptidici fra il 3° aa di una catena ed il 4° aa della catena parallela. In alcuni Gram + questo legame è intervallato da una pentaglicina.

14. Schema della disposizione delle varie unità monomeriche nelpolimero peptidoglicano Collegamento di polimeri adiacenti di peptidoglicano: A) mediante legame diretto tra i tetrapeptidi, B) attraverso un ponte pentaglicinico

15. Struttura della parete di un gram+ con strati sovrapposti di peptidoglicano Gram + Gram -

16. Differenze fra batteri Gram+ (a sinistra) e Gram- (a destra)

17. Differenze negli involucri esterni dei Gram+ e Gram- nei Gram+ la parete è uniforme, spessa 20-80 nm; nei Gram- la parete è più sottile (10nm) ma più complessa essendo dotata di una membrana esterna.

18. Parete dei Gram+ La parete è formata da molti strati di peptidoglicano, intersecati da acidi teicoici Gli ac. teicoici sono altamenti antigenici ed essenziali per legare alla superficie cellulare ioni + (es. Mg++) necessari al funzionamento degli enzimi di membrana. Ciò consente ai Gram+ di tollerare concentrazioni saline più elevate dei Gram- (vedi terreni selettivi). La parete dei Gram+ è molto polare (cariche degli Aa del peptidoglicano e del fosfato degli acidi teicoici) e permeabile a molecole idrofile (es. zuccheri, aminoacidi). Colorazione di Gram = cristalvioletto e iodio sono idrofili e penetrano. Il complesso cristalvioletto/iodio è idrofobico e non può riattraversare la parete.

19. Struttura degli acidi teicoici dei batteri gram-positivi Gli acidi teicoici sono polimeri di alcool polivalenti (glicerolo e ribitolo) esterificati con acido fosforico cui possono legarsi numerosi monosaccaridi e/o aminoacidi diversi

20. Parete dei Gram- I Gram- sono caratterizzati da una seconda membrana cellulare (membrana esterna) al di fuori della parete. MEMBRANA ESTERNA: Diversa dalla membrana citoplasmatica (membrana interna) in quanto è una struttura bilaminare asimmetrica con un foglietto interno di natura fosfolipidica e un foglietto esterno formata da un lipopolisaccaride (LPS).

21. Membrana esterna e parete sono collegate da lipoproteine (proteine di Braun) e la parete è priva acidi teicoici. • La presenza di lipidi nella membrana esterna non consentirebbe il passaggio di molecole idrofiliche, per cui sono presenti: • canali (“porine”) che consentono diffusione passiva di piccole molecole • proteine carriers per molecole più grosse. PERIPLASMA = spazio fra la membrana plasmatica interna e quella esterna. Ha la funzione di racchiudere in uno spazio limitato proteine ed enzimi con funzioni biologiche (es. che degradano i nutrienti, o detossificanti, o proteine di trasporto). I batteri Gram- sono insensibili ad alcuni antibiotici ed in particolare a quelli che impediscono la sintesi del peptidoglicano, in quanto questi farmaci difficilmente riescono ad attraversare la membrana esterna ed inoltre nello spazio periplasmico sono presenti enzimi che degradano gli antibiotici.

22. LPS consiste di tre parti: • Una parte lipidica all’interno (lipide A) • Una porzione polisaccaridica centrale (core) • Una lunga catena polisaccaridica esterna (Antigene O) • Il lipide A possiede un’azione tossica e costituisce l’endotossina dei Gram-

23. Capsula, glicocalice, strato mucoso • Si tratta di rivestimenti, esterni alla parete, formati da sostanze secrete dai batteri, generalmente polisaccaridi. • Il rivestimento costituito da polimeri, che formano uno strato denso ben definito attorno alla cellula è noto come capsula. • La rete a trama larga di fibre polimeriche è nota come glicocalice o slime e favorisce la formazione del biofilm • Una massa diffusa di fibre polimeriche apparentemente distaccata dalla cellula batterica prende il nome di strato mucoso

24. La Capsula Involucro mucoso più esterno, amorfo, costituita generalmente da polisaccaridi, che riveste numerosi batteri, sia Gram+ che Gram-. Funziona da adesina favorendo l’adesione dei batteri a specifici tessuti E’ un fattore di virulenza tipico di alcuni batteri patogeni poiché protegge i batteri dalla fagocitosi da parte dei macrofagi e dall’azione degli anticorpi presenti in circolo Impedisce l’azione di antibiotici (assorbe il farmaco impedendogli di raggiungere a concentrazioni ottimali le molecole bersaglio).

25. La capsula non è una struttura essenziale e la sua presenza dipende dal mezzo in cui i batteri crescono. Di solito i batteri patogeni sono capsulati in vivo, ma tendono a perdere la capsula in vitro. La presenza della capsula si evidenzia mediante colorazione negativa con inchiostro di china. I batteri con capsula hanno un alone chiaro non penetrato dall’inchiostro.

26. Il glicocalice Componente essenziale nella composizione di “biofilm”. Il biofilm viene definito come una comunità di batteri inclusi in un substrato di polimeri organici che aderisce a una superficie naturale o artificiale. Favorisce l’adesione dei batteri fra di loro e alla superficie di cellule e di tessuti o di materiale inanimato. La formazione del biofilm verrà descritta nella parte riguardante “patogenicità e virulenza”. glicocalice biofilm

27. FLAGELLI I batteri (soprattutto quelli di forma cilindrica) possono avere 1 o più flagelli. Originano dalla membrana plasmatica e si estendono 15-20 m dalla superficie. Responsabili di: ► Motilità = organi di propulsione, ruotano velocemente (come un’elica) da 10 a 100 giri/sec, in senso orario o antiorario. ► Chemiotassi = movimento stimolato dalla presenza di sostanze; i batteri si raggruppano nella zona che presenta condizioni ottimali per il loro metabolismo. C. positiva = “richiamo” esercitato da zuccheri, aminoacidi, ecc. C. negativa = “fuga” da sostanze dannose, es. acidi, alcoli. Chemiorecettori periplasmatici o di membrana danno le informazioni ai flagelli. Fonte di energia = non ATP, ma gradiente elettrochimico di protoni.

28. Fotografia al Microscopio Elettronico di Salmonella typhimurium (16.000 X). Il batterio in divisione presenta circa 100 pili e 12 flagelli • Monotrichi • Anfitrichi • Lofotrichi • peritrichi

29. Chemiotassi batterica Struttura del flagello

30. PILI e Fimbrie Appendici filamentose diverse dai flagelli. Presenti soprattutto nei Gram-, 100-300 in numero, lunghi 0.5-6 µm (i pili F raggiungono i 20 µm). Pili comuni o fimbrie = più numerosi e piccoli, sono organi di ancoraggio: (adesine). ► Aderiscono ai tessuti e condizionano la patogenicità Sono molto specifici nell’adesione perché interagiscono solo con alcuni zuccheri specifici. ► Incrementano la superficie cellulare attiva, potenziando attività di membrana (es respirazione, utilizzo di nutrienti, ecc). ► Negli stipiti patogeni di Enterobatteriaceae hanno la capacità di aderire a varie superfici mucose ed a materiale inerte (es.protesi) e favoriscono la formazione di “biofilm” Pili sessuali o di coniugazione = sono meno numerosi (di solito meno di 10 per cellula), più lunghi e più larghi. Codificati da fattori extracromosomici (plasmidi) intervengono nei processi di scambio genetico fra batteri.

31. Fimbrie Flagelli a Pili e fimbrie. (a) Escherichia coli con Fimbrie e flagelli; (b) due Escherichia coli Connessi da un pilo di coniugazione b