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C Capdeville-Atkinson , C Perrin-Sarrado, N Gambier, F Dupuis, C Gaucher, G Trocklé

UE6 Initiation à la connaissance du m é dicament - Module «  Pharmacologie g é n é rale  » - Item « Paramètres de quantification des effets pharmacologiques ». C Capdeville-Atkinson , C Perrin-Sarrado, N Gambier, F Dupuis, C Gaucher, G Trocklé.

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C Capdeville-Atkinson , C Perrin-Sarrado, N Gambier, F Dupuis, C Gaucher, G Trocklé

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Presentation Transcript

  1. UE6 Initiation à la connaissance du médicament - Module « Pharmacologie générale » - Item « Paramètres de quantification des effets pharmacologiques» C Capdeville-Atkinson, C Perrin-Sarrado, N Gambier, F Dupuis, C Gaucher, G Trocklé Livres: «Pharmacologie : des cibles vers l’indication thérapeutique», Yves LANDRY et Jean-Pierre GIES, Dunod, Paris 2009 «Initiation à la connaissance du médicament-UE6 1° année santé», Yves LANDRY, EdiScience, Dunod, Paris 2010

  2. Plan 1. Interaction Ligand - Récepteur 1.1 Les 3 propriétés importantes 1.2 Notion de ligand, agoniste, antagoniste 1.3 Loi d’action de masse 1.4 Théorie d’occupation des récepteurs 2. Méthodes d’étude de l’interaction Ligand - Récepteur 1.1 Approche fonctionnelle 1.2 Etude de liaison à haute affinité 3. Notion de sélectivité 4. CONCLUSION

  3. 1. Interaction Ligand - Récepteur

  4. 1.1 Les 3 propriétés importantes  Affinité = traduit lapuissance de l’interaction physico-chimique entre le ligand et son récepteur = capacité de reconnaissance entre les 2 partenaires - liaisons non covalentes(hydrophobes, ioniques, H, van der Walls)  Réponse = effet ou activité du ligand suite à sa fixation sur le récepteur  Sélectivité : - affinité préférentielle d’un ligand pour un récepteur par rapport à un autre - liée à la concentration utilisée : « l’important, c’est la dose » - production de médicaments de plus haute sélectivité Rapport effet primaire/effets secondaire 

  5. 1.1 Les 3 propriétés importantes médicament Cible (récepteur) Affinité reconnaissance mutuelle des 2 partenaires Couplage avec des effecteurs Sélectivité Transduction intracellulaire Réponse biologique  effet Activité

  6. 1.1 Les 3 propriétés importantes Transduction Amplification Modulation Signal de sortie Signal d'entrée effet récepteur Système amplificateur Système effecteur affinité activité

  7. 1.2 Notion de ligand, agoniste et antagoniste  Ligand : toute molécule se liant à un récepteur  Agoniste : molécule capable d’engendrer, par sa liaison à ses récepteurs, une réponse biologique semblable à celle du médiateur endogène  Antagoniste : molécule dont l’interaction avec les mêmes récepteurs ne déclenche pas de réponse biologique et s’oppose à l’effet du médiateur endogène

  8. 1.2 Notion de ligand, agoniste et antagoniste ANTAGONISTE AGONISTE Seconds messagers Absence de signal intracellulaire Cascade enzymatique - phosphorylations - déphosphorylations Réponse cellulaire Absence de réponse cellulaire - contraction - sécrétion - croissance et division - …..

  9. 1.2 Notion de ligand, agoniste et antagoniste Médiateur endogène

  10. 1.2 Notion de ligand, agoniste et antagoniste Médicament agoniste : mime l’effet du médiateur  entier (réponse cellulaire maximale)  partiel Médicament agoniste inverse : - s’oppose à la liaison du médiateur à son récepteur - entraîne une réponse opposée à celle de l’agoniste Médicament antagoniste neutre : - s’oppose à la liaison du médiateur à son récepteur - n’induit pas de réponse par lui-même mais  l’effet du médiateur endogène

  11. 1.3 Loi d’action de masse k1 [LR]  [L] + [R] k-1 Notion d’équilibre [L] : concentration molaire de ligand libre [R] : concentration molaire de récepteur libre [LR] : concentration molaire du complexe ligand-récepteur k1 : constante cinétique d’association (M-1 x min-1) k-1 : constante cinétique de dissociation (min-1) Modèle de la loi d’action de masse - équilibre dynamique entre formes libres et associées du ligand et récepteur - constante d’équilibre K (à une T°C donnée) - modèle satisfaisant pour les études de base

  12. 1.3 Loi d’action de masse Vitesse d’association = [L] x [R] x k1 - nombre de formation du complexe ligand-récepteur par unité de temps  Vitesse de dissociation = [LR] x k-1 - nombre de dissociation du complexe ligand-récepteur par unité de temps  A l’équilibre :les 2 vitesses sont égales : [L] x [R] x k1 = [LR] x k-1  ([L] x [R]) / [LR] = k-1/k1 = KD KD : constante de dissociation à l’équilibre (M) - KD dénommée KA pour agoniste - KD dénommée KB pour antagoniste Affinité: inverse de la constante de dissociation : - 1/KA pour agoniste - 1/KB pour antagoniste

  13. 1.3 Loi d’action de masse Affinité = 1/KA ou 1/KB = k1/k -1 = 1/KD En pratique : 1/KA et 1/KB = peu utilisées KA KB grandeur de concentration unité = Molaire Ligands à forte affinité  faible concentration pour se lier au récepteur (suggérant dose faible in vivo) Plus KD est faible, plus l’affinité est élevée KD = [L] nécessaire pour occuper 50 % des récepteurs à l’équilibre

  14. 1.4 Réponse et théorie d’occupation des récepteurs Formation du complexe LR Activité ou effet de L = Réponse de R Réponse cellulaire ou réponse de l’organisme Affinité réciproque de L et R

  15. 1.4 Réponse et théorie d’occupation des récepteurs 100 Effet (%) 50 0 0 50 100 Récepteurs occupés (%) 1.4.1 Théorie de l’occupation des récepteurs(Clark) • Réponse proportionnelle au pourcentage de récepteurs occupés • Lorsque 100% des récepteurs occupés  réponse maximale

  16. k 1 [AR] [A] + [R] k -1 Avec - [Rtot] = [R] + [AR] - KA = ([A] x [R])/[AR] 1.4 Réponse et théorie d’occupation des récepteurs Loi d’action de masse [A] : concentration molaire d’agoniste libre [R] : concentration molaire de récepteur libre [AR]: concentration molaire du complexe agoniste-récepteur Théorie d’occupation des récepteurs Si réponse  % de récepteurs occupés  Réponse = [AR]/[Rtot] Réponse = [A]/([A]+KA)

  17. 1.4 Réponse et théorie d’occupation des récepteurs 1.4.2 Evolution de la théorie de l’occupation des récepteurs Ariens réponse maximale obtenue pour une gamme de concentration = différente d’un agoniste à l’autre  facteur de proportionnalité propre à chaque agoniste : activité intrinsèque a= capacité du ligand à stimuler le tissu Réponse = [AR] / [Rtot] = aA/(A+KA) a = 1 : agoniste entier 0 < a < 1 : agoniste partiel a = 0 : antagoniste neutre a < 0 : agoniste inverse

  18. 1.4 Réponse et théorie d’occupation des récepteurs Théorie d’occupation des récepteurs complétée parStephensonetFurchgott: - Réponse maximale  faibles proportions de récepteurs occupés (2-20%) - notion derécepteurs de réserve = récepteurs libres alors que la réponse maximale est obtenue

  19. Conclusion : INTERACTION LIGAND - RECEPTEUR 3 propriétés : - Affinité - Réponse = Activité - Sélectivité Différents types de ligands : - Agoniste entier - Agoniste partiel - Antagoniste neutre - Agoniste inverse

  20. 2. Méthodes d’étude de l’interaction Ligand - Récepteur

  21. 2. Méthodes d’étude de l’interaction ligand - récepteur Etude des ligands : 2 approches 1) Approches fonctionnelles activité, affinité 2) Approches par liaison spécifique à haute affinité affinité, activité Objectif global : évaluation de l’activité, et de l’affinité du médicament pour le récepteur responsable de l’effet primaire et les récepteurs responsables des effets secondaires  notion de sélectivité d’un agoniste ou d’un antagoniste

  22. Les différents modèles d’étude de l’affinité et de l’activité des médicaments

  23. 2.1   Approches fonctionnelles Expériences fonctionnelles préliminaires caractéristiques nouveau ligand - Si ligand = agoniste : observation d’un effet propre du ligand en absence de médiateur endogène -Siligand = antagoniste :pas d’effet propre mais  effet du médiateur endogène ou d’un agoniste ajouté  Suivant agoniste ou antagoniste, protocoles expérimentaux différents

  24. 2.1   Approches fonctionnelles 2.1.1 Etude des agonistes  réponses graduelles : augmentent progressivement en fonction de la dose (in vivo) ou de la concentration (in vitro).  dose efficace 50(DE50) ou concentration efficace 50(CE50) : dose ou concentration nécessaire pour obtenir 50% de l’effet maximal

  25. 2.1   Approches fonctionnelles 2.1.1 Etude des agonistes Contraction (g) 3.10-5 M 3 10-5 M 3.10-6 M 2 10-6 M 3.10-7 M 1 10-7 M 3.10-8 M 10-8 M 10 20 30 0 40 Temps (minutes) Réalisation d’une courbe dose-réponse ou courbe concentration-réponse (doses ou concentrations cumulatives ) ex : courbe concentration réponse d’un anneau aortique isolé

  26. 2.1   Approches fonctionnelles 2.1.1 Etude des agonistes Effet Transformée en courbe sigmoïde 2.1.1.1 Détermination de Emax, DE50 ou CE50 Relation entre l’effet (E) et la dose, ou entre l’effet (E) et la concentration du médicament   courbe dose-réponse ou courbe concentration-réponse : Dose ou Concentration linéaire d’agoniste

  27. 2.1   Approches fonctionnelles 2.1.1 Etude des agonistes Transformation en courbe sigmoïde sur papier semi-logarithmique : Effet = f([Agoniste] en Molaire) (ou = f(dose, en quantité/kg)) Effet Effet max [Agoniste] (molaire, M) 10-9 M 10-8 M 10-7 M 10-6 M 10-5 M

  28. 2.1   Approches fonctionnelles 2.1.1 Etude des agonistes Effet Effet max [Agoniste] -log M 9 8 7 6 5 Transformation en courbe sigmoïde sur papier millimétré : Effet = f(- log [Agoniste])

  29. 2.1   Approches fonctionnelles 2.1.1 Etude des agonistes Effet Emax Effet = f(- log10 [A]) Augmentation répartie sur 2 unités log Emax/2 -log[A] 9 8 7 6 5 -log(CE50) CE50: concentration d’agoniste produisant 50% de l’effet maximal DE50: dose d’agoniste produisant 50% de l’effet maximal pD2 = -log10 (CE50)(traduit l’affinité, mais pas valeur d’affinité absolue) :plus pD2 élevé plus affinité forte Valeurs expérimentales non assimilables à constantes d’affinité - Comparables entre labos si conditions expérimentales identiques

  30. 2.1   Approches fonctionnelles 2.1.1 Etude des agonistes a = 1 a = 0,5 2.1.1.2. Détermination de l’activité : Emax et notion d’activité intrinsèque Effet (%) 100 A et B = Agonistes entiers A B C 50 C = Agoniste partiel -log[A] 9 8 7 6 -logCE50 -logCE50 NB : CE50 A < CE50 B et C donc affinité de A > B et C CE50 B = CE50 C (affinités identiques)

  31. 2.1   Approches fonctionnelles 2.1.1 Etude des agonistes 2.1.1.2. Détermination de l’activité : Emax et notion d’activité intrinsèque Agonistes entiers Effet (%) 100 en partie effet antagoniste de C par rapport à A ou B si A ou B présents en même temps que C A B C 50 Agoniste partiel -log[A] 9 8 7 6 • agoniste partiel (réponse maximale relativement faible) • suggère changement de conformation partiel du récepteur et signalisation intracellulaire faible • en présence d’un agoniste entier, les agonistes partiels exercent en partie un effet antagoniste (donc par ex, attention à l’administration d’un agoniste morphinique partiel(antalgique) chez un morphinoname = risque de précipiter un syndrome de manque)

  32. 2.1   Approches fonctionnelles 2.1.2 Etude des antagonistes Différents types d’antagonisme : Antagonisme compétitif:liaison de l’antagoniste sur le site de liaison de l’agoniste Antagonisme non compétitif :liaison de l’antagoniste sur un site de liaison du récepteur distinct du site de liaison de l’agoniste  pas d’effets propres  étude par observation de la modification de l’effet de l’agoniste correspondant

  33. 2.1   Approches fonctionnelles 2.1.2 Etude des antagonistes Effet agoniste seul + antagoniste Antagonisme surmontable:  déplacement courbe vers la droite  sans diminution effet maximum  pentes des courbes avec et sans antagoniste = parallèles Ex : cas des antagonistes compétitifsréversibles -log [agoniste]

  34. 2.1   Approches fonctionnelles 2.1.2 Etude des antagonistes Effet agoniste seul + antagoniste -log [agoniste] Antagonisme insurmontable :  diminution de l’effet maximum de l’agoniste  • Ex : cas des antagonistes non compétitifs

  35. 2.1   Approches fonctionnelles 2.1.2 Etude des antagonistes Effet agoniste seul + antagoniste -log [agoniste] 2.1.1.1 Détermination du pA2 (ou pKB) d’un antagoniste Pour antagonisme surmontable compétitif pA2 Etude de l’effet de plusieurs concentrations (doses) d’antagoniste sur la courbe concentration (dose)-réponse de l’agoniste  Déplacement vers la droite de la courbe concentration (dose)-réponse de l’agoniste est fonction de l’affinité de l’antagoniste et de sa concentration (dose)

  36. 2.1   Approches fonctionnelles 2.1.2 Etude des antagonistes • Quantification de la réponse de l’agoniste en absence et en présence antagoniste = fonction loi action de masse et théorie occupation des récepteurs  Réponse identique si conditions identiques d’occupation du récepteur par l’agoniste

  37. 2.1   Approches fonctionnelles 2.1.3 Etude des antagonistes AR A + R rA Effet E En absence d’antagoniste : Pour une concentrationAd’agoniste, une fraction des récepteursrA est occupée avec pour résultat un effet E

  38. 2.1   Approches fonctionnelles 2.1.2 Etude des antagonistes A ++B++ R AR + BR r’A Effet  : E En présence d’antagoniste : en présence d’antagoniste Bet de la même concentration A d’agoniste: -Compétition entre A et B pour se lier à R - Fonction des concentrations des ligands -  fraction des récepteurs occupés par la concentration A d’agoniste: r’A  effet pour la même concentration A d’agoniste

  39. 2.1   Approches fonctionnelles 2.1.2 Etude des antagonistes A ++B++ R AR + BR r’A Effet  : E A’ > A A’ ++B++ R A’R++BR r’A=rA Effet E Pour occuper même fraction de récepteurs et obtenir même effet, il faut augmenter la concentration d’agoniste A’ telle que A’>Aet rA = rA’

  40. En absence d’antagoniste : rA A ++B++ R AR + BR Effet E En présence d’antagoniste : AR A + R r’A Effet  : E A’ > A A’ ++B++ R A’R++BR r’A = rA Effet E

  41. 2.1   Approches fonctionnelles 2.1.2 Etude des antagonistes Calcul du rapport des concentrations équi-actives (ou rapport des doses équi-actives = « dose-ratio ») et représentation graphique de Schild  rapport de concentrations de l’agonisteoccupant la même fraction de récepteurs et donnant le même effet en absence et en présence d’une concentration d’antagoniste = A’/A = rapport des concentrations équi-actives log10 ((A’/A)– 1) = log10 [antagoniste] – log10 KB Représentation graphique : représentation de Schild = droite

  42. 2.1   Approches fonctionnelles 2.1.2 Etude des antagonistes log10 ((A’/A)– 1) = log10 [antagoniste] – log10 KB  pA2 = - log de [antagoniste] (molaire) qui oblige à doubler la concentration d’agoniste pour obtenir le même effet qu’en absence d’antagoniste lorsque log ((A’/A) – 1) = 0  A’/A = 2 Intersection de la droite de Schild avec axe des abscisses  pA2  Plus le pA2 est , plus l’affinité de l’antagoniste pour le récepteur 

  43. Effet agoniste seul log (c-1) 10 a 3 Représentation graphique de Schild b log (b-1) 10 c 2 log (a-1) 10 1 Log 10 (A’‘’‘’’/A - 1) 0 [agoniste] A’’ A’’’ A A’ A+antagoniste B : [B1] a = A’/A pA 2 A+antagoniste B : [B2] b = A’’/A A+antagoniste B : [B3] c = A’’’/A - log10 [antagoniste] 2.1   Approches fonctionnelles 2.1.2 Etude des antagonistes

  44. 2.2   Liaison spécifique haute affinité permet caractériser l’affinitéd’une nouvelle molécule synthétisée vis à vis de récepteurs connus  détermination de KD  permet caractériser les récepteurs d’un tissu ou d’une cellule en utilisant des ligands connus  détermination de Bmax (nombre maximal de récepteurs)

  45. 2.2   Liaison spécifique haute affinité 2.2.1 Réalisation des études de liaison • Préparations subcellulaires : • * homogénat • * membranes • * récepteurs purifiés ou cellulaires - Utilisation de ligand marqué = radioligand (L*) : 3H, 14C, 125I - 3 étapes : incubation, séparation, mesure

  46. 2.2   Liaison spécifique haute affinité * * * L*R L* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * Incubation Séparation Mesure récepteurs radioligand L* en présence d’une population de récepteurs (conditions précises de temps, pH, T°C)  formation complexe L*R Mélange scintillant Centrifugation ou filtration  séparation ligand libre L* et complexe L*R Radioactivité retenue sur le filtre  quantification complexe L*R

  47. 2.2   Liaison spécifique haute affinité Mesure de la liaison totale = liaison spécifique + liaison non spécifique Liaison spécifique :liaison à des récepteurs - forte affinité - critère de saturabilité Liaison non spécifique :liaison à sites de fixation autres que récepteurs - faible affinité - non saturable

  48. 2.2   Liaison spécifique haute affinité Méthode par saturation Méthode par compétition Protocoles expérimentaux permettant de déterminer liaison spécifique

  49. 2.2   Liaison spécifique haute aff 2.2.2 Méthode par saturation Première série d’expériences = concentration récepteur fixe et concentrations croissantes de ligand marqué (L*):  détermination de la liaison totale Deuxième série d’expériences = tubes dans conditions identiques + surcharge ligand non marqué (L): - Compétition entre L et L* - L >> L*  L en excès déplace L* des récepteurs (car nombre limité) - mais pas de compétition pour les sites de liaison non spécifiques (car nombre infini) détermination de la liaison non spécifique

  50. 2.2   Liaison spécifique haute aff 2.2.2 Méthode par saturation Liaison du radioligand L*R liaison totale liaison spécifique liaison non spécifique [L*] Liaison spécifique = différence entre les 2 mesures

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