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TRIzol 法提取 RNA

TRIzol 法提取 RNA. 白洁. TRIzol 的作用成分. 苯酚：主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质 解聚得到释放。 8 －羟基喹啉：抑制 RNase 异硫氰酸胍：属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂， 可使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降 解，核蛋白与核酸分离 β- 巯基乙醇：破坏 RNase 蛋白质中的二硫键. 原理.

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TRIzol 法提取 RNA

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Presentation Transcript

  1. TRIzol法提取RNA 白洁

  2. TRIzol的作用成分 • 苯酚：主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质 解聚得到释放。 • 8－羟基喹啉：抑制RNase • 异硫氰酸胍：属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂， 可使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降 解，核蛋白与核酸分离 • β-巯基乙醇：破坏RNase蛋白质中的二硫键

  3. 原理 • Trizol试剂能够裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，将RNA释放到溶液中去，加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。

  4. 试剂准备： TROzol：裂解细胞，使细胞中的蛋白核酸物质解聚得到释放 KAc（4M，PH=4.8）：去多糖以及其它杂质，提供酸性环境 NaAc（3M，PH=5.2）：提供一价阳离子中和RNA的负电荷，从而中和RNA 分子间排斥作用，以达到共沉淀的效果 氯仿：一是能变性蛋白,抑制RNase活性 ，二是把水相里残余的苯酚抽提 掉；三是作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质（比如油脂、脂溶 性色素等），起到一定除杂作用 异丙醇：沉淀RNA 75%乙醇 ：洗去残留异丙醇以及盐离子 无水乙醇：沉淀RNA

  5. 提取过程 • 一、样品抽提： 1、取植株幼嫩的叶片60-70mg，快速装入EP管，投到液 氮当中 2、在通风厨内进行研磨，所用研磨棒在NaOH中浸泡20min 左右，再用DEPC水冲洗 3、研磨至粉状后加入1mlTROzol，迅速混匀后室温静置 10min以上

  6. 二、分相： 4、加入335µl KAc，混匀后静置20-30min，12000g，6℃离心15min 5、在装有裂解物的离心管中加入0.2ml的氯仿，手摇混匀30s，室温下静置5分钟 6、12000 rpm 6℃离心15min,分相为三层。上层：RNA；中间：DNA；下层:蛋白质。 7、小心吸取上清液，转移到另一EP管中。1ml裂解物产生的上清液体积约为0.4～0.6 ml，有机相和中间层含有DNA和蛋白质,避免触及。（除去了DNA和蛋白）

  7. 三、RNA沉淀： 8、上清液加入约0.5ml的异丙醇,放置1h以上（可过夜沉 淀）。 9、12000rpm， 6℃离心10min  。 10、RNA沉淀将在离心底的侧面形成。小心吸弃上清液,注 意避免吸弃RNA沉淀。

  8. 四、RNA清洗： 11、加入1ml 预冷的75%乙醇(1mlTrizol至少1ml乙醇清洗)，用手将沉淀弹起来，7000g 6℃离心5min。（两次） 12、去上清，离心30s，将残余液体吸取除去 13、室温下干燥，加入0.2mlDEPC水，20µlNaAc,660µl无水乙醇，混匀后-20 ℃静置1h以上（可过夜） 14、 12000g，6℃离心5min，弃上清，离心30s，残余液体吸取除去，晾干后加入DEPC水溶解。

  9. 五、检测： 取0.5µlRNA样品，用1%琼脂糖电泳检测质量 用超微量紫外分光光度计进行定量 260/280 260/230 c(ng/µl) 2.05 2.04 1207.7 2.04 2.02 921.9

  10. 常见问题分析： • 得率低：A.样品裂解或匀浆处理不彻底。B.RNA沉淀未完全溶解。 • A260/A280<1.8 ：A.样品匀浆时加的试剂量太少。B.匀浆样品时未在室温放置5分钟。C.吸取水相时混入了有机相（内含蛋白,酚类）。D.RNA沉淀未完全溶解。 • RNA降解：A.组织取出后没有马上处理或冷冻。 B.溶液或离心管未经RNase去除处理。

  11. DNA污染： A. 样品匀浆时加的试剂量太少。B. 吸取水相时吸入了DNA。 • 蛋白聚糖和多糖污染：　　沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染，步骤7中，每使用1ml TRIzol在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液（0.8M柠檬酸钠和1.2MNaCl）混合离心，按之前操作进行。这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出纯RNA。从含有大量多糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离心，并加上以上操作步骤。

  12. Thank you

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