Biológiai terápiás lehetőségek a komplementrendszer működésének befolyásolására

1. Biológiai terápiás lehetőségek a komplementrendszer működésének befolyásolására Prohászka Zoltán, III. Sz. Belgyógyászati Klinika, Kutatólaboratórium Semmelweis Egyetem, Budapest prohoz@kut.sote.hu

2. Biológiai terápia • A biológiai terápia olyan gyógyszeres eljárásra utal, amelyet valamely pontosan meghatározott immunológiai célpont ellen vetnek be, vagy immunológiai mechanizmus indukálásával kívánják elérni a kívánt hatást. • A célzott terápia a klinikai immunológiában és onkológiában arra utal, hogy egy gyógyászati eljárás a hatását specifikus módon, egyetlen meghatározott targeten keresztül fejti ki, szemben az elterjedt hagyományos eljárásokkal, melyek kevésbé specifikusak (pl. szteroidok, citosztatikumok). • A célzott terápiák speciális formája a szubsztitúciós terápia, melynek során valamely jobban vagy kevésbé tisztítotthiányzó „faktort” juttatunk be a beteg szervezetébe. Tág értelmezés szerint ide tartoznak véralvadási faktorok, hormonok, stb. • A biológiai választ módosító szerek (BRM) legtöbbször citokin, interferon, növekedési faktor vagy kolónia stimuláló faktor csoportokban tatoznak, és biológiai folyamatok módosításán keresztül fejtik ki hatásukat (pl. sejtnövekedés indukálása). • Védőoltások

3. A biológiai terápiás eljárások fejlődésének mérföldkövei • Szérum terápia a diftéria (torokgyík) gyógyítására (1890)

4. Az első olyan orvosi terápiás beavatkozás, amelyet a betegség okának megértése és hatékony megcélzása segítségével alkottak meg Edwin Klebs 1834-1913 Emil von Behring 1854-1917 Orvosi Nobel díj, 1901: „a szérumterápia terén végzett munkájáért, különösen annak a diftéria elleni alkalmazásáért, ahol úttörő munkát fejtett ki, és hatásos fegyvert adott az orvostudomány kezébe a betegség és a halál elleni küzdelemben” Diftéria antitoxin, 1890 Bókay János ifj. 1858-1937 „nemzetközi felkérésre klinikailag ellenőrizte a Behring-féle diftériaellenes gyógysavó oltás hatását” 1894 október Corynebacterium diphtheriae Klebs-Löffler bacillus (1883) Tom, a ló (1894, London)

5. A biológiai terápiás eljárások fejlődésének mérföldkövei • Szérum terápia a diftéria (torokgyík) gyógyítására (1890) • Az agammaglobulinaemia (közönséges variabilis immundeficiencia) gyógyítása tisztított immunglobulin G-vel (IVIG, Humaglobin, stb…1952) • A monoklonális antitesttermelés elvének és gyakorlatának kidolgozása (Köhler és Milstein, 1975), és az első egér-monoklonális antitestterápia kifejlesztése a transzplantációt követő rejekciós epizódok kezelésére (Muromonoab-OKT3, 1986)

6. César Milstein Niels K Jerne Georges JF Köhler • Orvosi Nobel díj, 1984 • Niels K. Jerne, Georges J.F. Köhler és César Milstein • "for theories concerning the specificity in development and control of the immune system and the discovery of the principle for production of monoclonal antibodies".

7. A biológiai terápiás eljárások fejlődésének mérföldkövei • Szérum terápia a diftéria (torokgyík) gyógyítására (1890) • Az agammaglobulinaemia (közönséges variabilis immundeficiencia) gyógyítása tisztított immunglobulin G-vel (IVIG, Humaglobin, stb…1952) • A monoklonális antitesttermelés elvének és gyakorlatának kidolgozása (Köhler és Milstein, 1975), és az első egér-monoklonális antitestterápia kifejlesztése a transzplantációt követő rejekciós epizódok kezelésére (Muromonoab-OKT3, 1986) • A molekuláris biológia fejlődése az elmúlt években lehetővé tette, hogy • Moreover, the progress of molecular and transgenic technologies has enabled the development of • Antitest-kimérák (Abciximab-ReoPro (Gp IIb-IIIa, 1994) és Rituximab-Rituxan (CD20, 1997), • Humanizált ellenanyagok (complementarity-determining region; CDR-grafted) mAb, Trastuzumab-Herceptin (Her2/Neu, 1998) and Infliximab-Remicade (TNFa, 1998) • és teljesen humán ellenanyagok (phage display–derived Adalimumab-Humira (TNFa, 2002) és transgenic mouse-derived Panitumumab-Vectibix (EGFR, 2006) • A fenti, és hasonló más szerek kifejlesztésének sikere lehetővé tette, hogy korábban kezelhetetlen, vagy csak nem-specifikus módon kezelhető betegségek sikerrel befolyásolhatók, sőt egyes esetekben gyógyíthatók legyenek. Ezek a betegségek az autoimmun-gyulladásos és a daganatos betegségcsoportokba tartoznak.

8. Visszatekintés és előrejelzés a monoklonális antitestterápiás szerek forgalmára (millió US dollár) 8

9. Visszatekintés és előrejelzés a monoklonális antitestterápiás szerek forgalmára (millió US dollár)- az érintett vállalatok 9

10. Az előadás további részének vázlata • Áttekintés a monoklonális antitest-alapú terápiákról • A humán antitestek előállításához használt molekuláris biológiai eljárások áttekintése • A biológiai terápiás szerek klinikai használatának bemutatása a komplementrendszer pédáján

11. Két könnyű lánc/molekula (kappa vagy lambda) Két nehéz lánc/molekula (mu, gamma, delta, alpha vagy epsilon A humán immunoglobulin G szerkezete Antigénkötő régió Könnyű lánc (L) Variable (V) domains (VL and VH domains) Nehéz lánc (H) Constant (C) domains (CL, CH1, CH2, CH3)

12. A komplementaritást meghatározó (CDR) hipervariábilis régiók a könnyű és nehéz láncokon

13. Hogyan lehet előállítani nagy mennyiségben humanizált, vagy humán monoklonális ellenanyagot? • A variábilis domének (VH és VL) hipervariábilis régióinak (3+3) ismerete szükséges hozzá • Ez a szekvencia unikális, csak immunizálást vagy fertőzést követően alakul ki az érett B-sejtekben • A konstans domének szekvenciája is szükséges • Ezek ismertek és rendelkezésre állnak • Az egér monklonális antitestek genetikai módosítása • Kiméra előállítása (egér és emberi jelleg felismerhető) • Humanizálás (egér jelleg kimutatható) • Emberi antitestek előállítása (tisztán emberi antitest) • Hibridóma technológia • Antitest (fág) könyvtár • Transzgenikus állatok

14. Egér-elleni immunválasz bekapcsolása • „HAMA”: human anti-mouse antibodies • A szer aktivitásának csökkenése • nem kívánt mellékhatások megjelenése • Interferencia immunassay-ben

15. Tisztán emberi antitestek előllítása Single-chain Ab

16. A konstans domének tervezése és kiválasztása • A konstans domének határozzák meg a következő funkciókat: • Biológiai hatások • Fc receptorokhoz való kötődés, jelátvitel • Komplement és sejt aktiváció (IgG1: ADCC reakcióés CDC) • Neutralizáció (IgG4) • Fél-életidő és raktározódás (melyeket a cukor oldalláncok, azaz áttételesen a termeltetési rendszerek határoznak meg) • Szövet/Sejt kultúra: prokaryota, élesztő, rovarsejt, eukaryota • Élő szervezetek: transzgénikus növények, állatok • A termeltetés helye • Véráram (szérum) • Tej (szekretoros komponens)

17. Biológiai terápiás lehetőségek a komplementrendszer működésének befolyásolására: példák • A komplementrendszer a vérplazmában található enzimrendszer, amely zymogén alakban keringő szerin proteázokból, aktiváló és szabályozó fehréjékből és sejtfelszíni receptorokból áll • A komplementrendszer részét képezni a komplex plazma szerint proteáz rendszernek, melynek tagjai: • Véralvadási rendszer • Fibrinolitikus rendszer • Kontakt (kinin-kallikrein) rendszer • Komplement rendszer • A négy rendszer közös működését azért indokolt feltételezni, mert aktivátoraik és szabályozó fehérjéik részben közösek, továbbá „horizontális” kapcsolatok is kimutathatók

18. Makrofágok Dentritikus sejtek Hízósejtek B sejtek Monociták T sejtek Neutrofilek Komplement rendszer Veleszületett immunitás Eltakarítás Adaptív immunitás • Opszonizáció • Pathogének lízise • Kemotaxis • Gyulladás • Sejtaktiváció • Immunkomplexek • és apoptotikus • sejtek eltávolítása • Antitestválasz augmentációja • T-sejt válasz elősegítése • Saját antigénekkel reagáló • B-sejtek eltávolítása • Immun-memória fokozása

19. A komplementrendszer működésének vázlata Klasszikus út (Immunkomplex) Alternatív út (Spontán C3 aktiváció) B faktor, D faktor C3 aktiváció Regulátorok: C1-inhibitor, C4-kötő fehérje, I-faktor Regulátorok: MCP, CD59, H-faktor, I-faktor Lektin út (Szénhidrát struktúra) Alternatív út amplifikáció C3b Opszonizáció Antigénprezentáció Antitesttermelés C5 aktiváció Regulátorok: S protein and Clusterin Anafilatoxinok C3a, C5a Gyulladáskeltő hatás Kemotaxis Terminális reakcióút Lízis Sejtkárosító hatás Apoptózis indukció

20. A komplementrendszerrel kapcsolatos humán betegségek • Hiányállapot (genetikai alapon, vagy szerzett) • C1-inhibitor (herediter angioödéma) • Alternatív reakcióút regulátorok (Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria, atypical Hemolytic Uremic Syndrome, ) • Terminális út komponensek (meningitis) • Kóros aktiváció • Autoimmun betegségek (immunkomplex betegségek) • Transzplantációt követő rejekció • Ischemias/reperfúziós károsodás (stroke, myocardialisinfactus, etc…) • Hemodialízis, on-pump szívműtét • Kóros aktiváció és konszumpció • Sepsis • Kóros terhesség, preeclampsia, HELLP szindróma, • Disszeminált intravaszkuláris koaguláció (DIC) • Komplementtel kapcsolatos biológiai terápiák • A hiányzó faktor pótlása (szubsztitúció) • A kóros aktiváció nem-specifikus gátlása • A komplementaktiváció célzott gátlása

21. A herediter angioödéma szubsztitúciós kezelése C1-inhibitor koncentrátummal Klasszikus út (Immunkomplex) Alternatív út (Spontán C3 aktiváció) B faktor, D faktor C3 aktiváció Regulátorok: C1-inhibitor, C4-kötő fehérje, I-faktor Regulátorok: MCP, CD59, H-faktor, I-faktor • Életveszélyes, ödémás rohamokban jelentkező kórkép(Bradikinin túltermelés) • AZ ödémás rohamok kezelése C1-inhibitor koncentrátummal lehetséges • Tisztított humán C1-inhibitor • Berinert P/Behring • Nanofiltrated: Cetor/Sanquin vagy Cinryze/ViroPharma (a 4. legdrágább gyógyszeres kezelés, 350.000 $/év) • Recombinant human C1-inhibitor • Rhucin/Pharming Lektin út (Szénhidrát struktúra) Alternatív út amplifikáció C3b Opszonizáció Antigénprezentáció Antitesttermelés C5 aktiváció Regulátorok: S protein and Clusterin Anafilatoxinok C3a, C5a Gyulladáskeltő hatás Kemotaxis Terminális reakcióút Lízis Sejtkárosító hatás Apoptózis indukció

22. A patológiás komplementaktiváció fékezése szolubilis komplement receptor 1-el (sCR1, TP10) Klasszikus út (Immunkomplex) Alternatív út (Spontán C3 aktiváció) B faktor, D faktor C3 aktiváció Regulátorok: C1-inhibitor, C4-kötő fehérje, I-faktor Regulátorok: MCP, CD59, H-faktor, I-faktor Lektin út (Szénhidrát struktúra) Alternatív út amplifikáció C3b Opszonizáció Antigénprezentáció Antitesttermelés C5 aktiváció sCR1 (soluble complement receptor 1) Regulátorok: S protein and Clusterin • Több támadáspontú gátlás • Alkalmazásának célja az I/R károsodás kedvezőtlen hatásainak kivédése volt (pl. by-pass műtét során) • Nem születtek átütő eredmények, vizsgálatát abbahagyták 2007-ben Anafilatoxinok C3a, C5a Gyulladáskeltő hatás Kemotaxis Terminális reakcióút Lízis Sejtkárosító hatás Apoptózis indukció

23. A patológiás komplementaktiváció célzott fékezése Klasszikus út (Immunkomplex) Alternatív út (Spontán C3 aktiváció) B faktor, D faktor C3 aktiváció Regulátorok: C1-inhibitor, C4-kötő fehérje, I-faktor Regulátorok: MCP, CD59, H-faktor, I-faktor Lektin út (Szénhidrát struktúra) Alternatív út amplifikáció C3b Y Opszonizáció Antigénprezentáció Antitesttermelés IgG4 Eculizumab (humanizáltegér anti-C5 Ab) A világ legdrágább gyógyszere, 409.500 $/year Pexelizumab (scV anti-C5 Ab) C5 aktiváció Regulátorok: S protein and Clusterin Anafilatoxinok C3a, C5a Gyulladáskeltő hatás Kemotaxis Terminális reakcióút Lízis Sejtkárosító hatás Apoptózis indukció

24. Az eculizumab jelenlegi on-label indikációja és off-label felhasználásai • On-label: Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria (PNH) • A haematológiai őssejtek betegsége, melynek során egyes klónok elveszítik a GPI-horgony molekulájukat, ezáltal a sejtek felszínén számos (köztük aCD59 és DAF) membránfehérje expressziója elvész • A vörösvértestek fokozottan érzékenyek a komplement mediált lízissel szemben • Krónikus, progresszív betegség, melyet visszatérő trombózisok és szerv-ischemia jellemez • Jelenlegi terápiája rendszeres transzfúziókra, antikoagulációra és csontvelő transzplantációra épül, azonban 2007 óta célzott terápia is lehetséges eculizumabbal • Off-label felhasználás: Folyamatban lévő klinikai vizsgálatok Eculizumab-al • Atípusos hemolyticus uremias szindróma • Időskori makuladegeneráció • Vesetranszplantációt követő, komplement-mediált kilökődési reakció • Dense-deposit disease, C3-nefropátia • Neuromyelitis optica • Katasztrófális Antiphospholipid szindróma • Hideg-agglutinin betegség • ANCA-vasculitis • Sarlósejtes betegség

25. Ismert etiológia, alapbetegség nélkül Infekciók Shiga-like toxin termelő patogének Neuraminidázt termelő patogének Sérült komplement reguláció Alternatív út Thrombomodulin A von-Willebrand faktortermelés zavara Szerzett ADAMTS13 gátló antitestek Veleszületett ADAMTS13 hiány (Upshaw-Schülman sy) Szekunder formák, alapbetegséggel Típusos klinikai megjelenés Akut veseelégtelenség, HUS Kritikus állapot, HUS Akut veseelégtelenség, HUS Akut neurológiai panaszok, TTP TMA mint súlyos szövődmény A trombotikus mikroangiopátiák egyszerűsített klasszifikációja(Besbas et al., 2006, Kidney Int. alapján)

26. Ismert etiológia, alapbetegség nélkül Infekciók Shiga-like toxin termelő patogének Neuraminidázt termelő patogének Sérült komplement reguláció Alternatív út Thrombomodulin A von-Willebrand faktortermelés zavara Szerzett ADAMTS13 gátló antitestek Veleszületett ADAMTS13 hiány (Upshaw-Schülman sy) Szekunder formák, alapbetegséggel A komplementaktivitás funkcionális mérése CH50 és WIELISA-ALT Komplementfehérje mérések C3, C4, FH, FB, FI Mutáció szűrés CFH exons 2, 4, 6, 9 14-15, 17, 18, 20-23 CFI exons 3, 5-6, 9-10, 12-13 CD46 exons 5-6 C3 exons 14, 20, 26-27, 37 CFB exons 6-7 THBD in progress Haplotípus analízis CFH tag SNPs MCP tag SNPs Kópiaszám meghatározása 1q32 régióban (MLPA) Anti-HF IgG vizsgálata az autoimmun forma fennállásának igazolására Laboratóriumunkban a TMA-s betegek kivizsgálása során alkalmazott vizsgálóeljárások

27. Az aHUS betegek jelenlegi és jövőbeli terápiájának alapvonalai A betegség rohamokban fellépő shubokban zajlik (hemolízis fragmentált eritrocitákkal, LDH növekedés, alacsony trombocitaszám) Terápia: Plasmacsere Immunszuppresszió Citosztatikumok ESRD, dialízis, tx Eculizumab 900 mg/hét 4 héten át, azt követően 1200 mg/két hét

28. Az atípusos HUS autoimmun formája (Avagy a biológiai terápiás szerek felhasználása autoimmun betegségekben) • H-faktor ellenes, funkcionálisan aktív, patogén, gátló autoantitestek • Genetikai kapcsoltságot mutat a CFHR1-3 gének deléciójával • A H faktor funkcionálisan aktív N-terminálisát blokkolják • Ezáltal elvész a molekula szabályozó funkciója • Specifikus beavatkozási lehetőség: A patogén autoantitesteket termelő B-sejt klónok eliminálása

29. Rituximab (Rituxan, MabThera) • Anti-CD20 monklonálisantitest (humán-egérkiméra) melyet a B-sejtes limfómák gyógyítására fejlesztettek ki (B-sejt depléció) • A sejtfelszíni CD20 ligandja nem ismert, a molekula a membrán átfolyó calcium áram szabályozásában vesz részt • A hatásmechanizmus kiterjed ADCC reakció és komplement-mediált lízis kiváltására, apoptózis indukcióra és az Fc-receptorok telítésére • Újabban széles körben megkezdték a gyógyszer alkalmazását olyan betegségekben, melyekben patogén autoantitesteket termelő B-sejtek depléciója a terápiás cél • Egy kezelési ciklus 4 injekcióból áll (375 mg/m2, hetente), melynek hatására a CD20 pozitív B sejtek két évre eliminálódnak a perifériáról Jonathan C. W. Edwards & Geraldine Cambridge: Nature Reviews Immunology 6, 394-403(May 2006)

30. CD20-pozitív B-sejtek eliminálása autoimmun betegségekben: a megcélzott betegségek listája 2010-ben • Rheumatológiai betegségek • Rheumatoid arthritis • Systemic lupus erythematosus (SLE) • Sjögren szindróma • Dermatomyositis és polymyositis • Vasculitis-ek • Egyéb autoimmun betegségek • Idiopátiás thrombocytopeniás purpura (ITP) • Thrombotic thrombocytopeniás purpura (TTP) • Autoimmun hemolitikus anémia (AIHA) • Pemphigus vulgaris és foliaceus Perosa et al, J Intern Med, 2010

31. Haematoma evac. Hysterect. 109 /l Curettage Sectio Hgmm IVIG g/l TTP megállapítása Feresis Madách K és mtsai: Aneszteziológia és Intenzív Terápia, 2008; 38(1): 34-38

32. Az intravénás Ig (IVIG) hatásmechanizmusa gyulladásos és autoimmun betegségekben • Az Fc-receptorok blokkolása a retikuloendoteliális rendszer makrofágjain • Azidiotípus–anti-idiotípus hálózat helyreállítása • Citokinek hatásának gátlása (anti-citokin antitestek) • Sejt-adhézió gátlása anti-adhéziósmolekula antitestek által • Gyulladásos mediátorok (komplement anafilatoxinok) gátlása • Az FcRn receptorok szaturálása, és ezáltal a saját immunglobulin pool lebomlásának elősegítése • B-sejtek növekedésének gátlása (pl. BAF neutralizálásán keresztül) • A T-sejt proliferáció gátlása • A dendritikus sejtek érésének gátlása Ballow M, JACI, 2011

33. Mechanisms of action of intravenous immune globulin (IgIV) on the immune modulation of various components of the innate and adaptive immune systems. (Adapted from Tha-In et al. Trend Immunol, 2008) DC, Dendritic cell; Mo, monocyte; NK, natural killer.

34. Összefoglalás • 2011-ben 29 cég érdekelt a monoklonális antitest-alapú terápiák területén, összesen 52 termékkel. Ezek indikációi több száz betegségre terjednek ki, és évente mintegy 40 milliárd US dolláros forgalmat eredményeztek • Számos olyan betegség, melyek korábban nem, vagy csak nem-célzott kezeléssel (pl. szteroidok, citosztatikumok) voltak kezelhetőek, jól befolyásolhatóvá, sőt egyes esetekben gyógyíthatóvá váltak • A folyamatos termékfejlesztésnek és tudományos fejlődésnek hála, az újabb szerek • Based on continuous product development, there is • egyre hatékonyabbak (jól megtervezett biológiai hatások) • egyre kevesebb mellékhatással bírnak (humán antitestek) • A biológiai terápiás szerek off-label használata divatba jött, és a kedvező tapasztalatok felhalmozódásával nagy valószínűséggel számos új indikáció fog megjelenni a közeli években • Pl. rituximab autoimmun betegség esetén • A szubsztitúciós terápiákban használt szerek alternatív felhasználása is egyre élénkebben kutatott terület • Pl. IVIG a gyulladásos/ autoimmun kórképek befolyásolására • Hamarosan várható az első generikus biológiai terápiás szerek megjelenése a piacon (pl. rituximab esetén 1997+15=2012) • Bioszimilaritás bizonyítása szükséges, ebben az esetben nem ételmezhető a bioekvivalencia

35. Köszönöm a figyelmet! www.kutlab.hu