MYCOBACTERIA

1. MYCOBACTERIA

2. Mycobacteria • Bacilli (2-4 µm), forme filamentose (molto sottili fino a 10-15 µm) • Immobili • Asporigeni • Sprovvisti di capsula • Aerobi obbligati • Alcool-acido resistenti

3. Classificazione

4. Struttura cellulare • Parete cellulare molto spessa • Componenti della parete: peptidoglicano, diaminopimelato, polisaccaridi (glucano, mannano, arabino-galattano, arabino-mannano) • Inclusi citoplasmatici (lipidi, glicogeno, polimetafosfati)

6. Parete cellulare • Composizione: • Grosse quantità di glicolipidi: • acido micolico (60%) • complessi lipidi-arabinogalattani • lipoarabinomannani • Scarso petidoglicano

7. Gran parte delle proprietà esclusive che caratterizzano il genere Mycobacterium sono, direttamente o indirettamente, legate alla struttura della parete cellulare

8. Mycobacterium spp.Parete cellulare • Funzioni: • Forma e prevenzione lisi osmotica (peptidoglicano) • Inibizione ingresso composti chimici • Crescita lenta • Maggiore resistenza agli agenti chimici • Maggiore resistenza alla fagocitosi • Induzione sintesi citochine (TNF-) da parte dell’acido micolico

9. I LIPIDI DELLA PARETE BATTERICA • GRASSI SOLUBILI IN ACETONE • CERE • FOSFATIDI

10. CERE • Le CERE, esteri di acidi grassi (fra i quali gli acidi micolici) ed alcoli. La cera D, che in realtà è un glicopeptidolipide, è soprattutto nota per le sue proprietà adiuvanti; essa infatti, se inoculata in emulsione idro-oleosa associata ad un antigene proteico, potenzia enormemente la risposta immune umorale e cellulare del soggetto ricevente verso l’antigene suddetto.

11. ACIDI MICOLICI • Gli ACIDI MICOLICI sono quelli che più di frequente si trovano esterificati nelle molecole lipidiche, si tratta di acidi grassi β-idrossilati caratterizzati da una lunga catena satura di atomi di C (da 83 a 93) A livello della superficie esterna del cell wall gli acidi micolici svolgono la funzione di recettori fagici.

12. FATTORE CORDALE Un micoside oggetto di studi approfonditi è il DIMICOLIL-TREALOSO meglio noto col nome di FATTORE CORDALE, così chiamato perché i micobatteri tubercolari, privati di tale sostanza, perdono la caratteristica di svilupparsi, su certi terreni di coltura, in fasci serpentiformi.

13. FOSFATIDI • Consistono di glicerolo esterificato con acidi grassi (palmitico, oleico) e con acido fosforico Sono capaci di evocare da soli una reazione cellulare granulomatosa caratteristica e sovrapponibile a quella che si osserva nell’infezione tubercolare

14. CARATTERISTICHE ANTIGENICHE ANTIGENI Natura Polisaccaridica (parete cellulare) Natura proteica (citoplasmatici) Arabinogalattani Immunogeni solo se inoculati insieme alle cellule Responsabili della sensibilizzazione di tipo allergico

15. Mycobacterium tuberculosis

16. MECCANISMI DELL’AZIONE PATOGENA • La tubercolosi è un’affezione polmonare e pertanto diffonde per via aerea da uomo a uomo attraverso i nuclei essiccati delle goccioline di saliva emessi con la tosse dei malati di tubercolosi • La prima infezione si traduce in un’infiammazione localizzata a carattere essudativo di un limitato distretto del parenchima polmonare con compromissione dei linfonodi mediastinici (COMPLESSO PRIMARIO)

17. Mycobacterium tuberculosisin lung

18. MECCANISMI DELL’AZIONE PATOGENA • Al complesso primario segue uno STATO ALLERGICO evidenziabile mediante iniezione di TUBERCOLINA che generalmente dura tutta la vita • In seguito ad una reinfezione o riattivazione del complesso primario, l’infezione può compromettere il parenchima polmonare e diffondere a qualsiasi organo

19. DIAGNOSI DI LABORATORIO • ESAME MICROSCOPICO • ESAME COLTURALE • IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA • TIPIZZAZIONE FAGICA • ANTIBIOGRAMMA

20. ESAME MICROSCOPICO • FLUORESCENZA • COLORAZIONE DI Ziehl-Neelsen

21. FLUORESCENZA 400x

22. ESAME MICROSCOPICOCOLORAZIONE DI Ziehl-Neelsen L’esame microscopio assume, per la ricerca dei micobatteri, una rilevanza diagnostica che non trova riscontro in altri settori della batteriologia, e ciò grazie alla peculiare proprietà di tali microorganismidi essere alcool-acido resistenti. La natura della alcool-acido resistenza non è ancora del tutto chiarita, essa sembra comunque correlata alla componente lipidica della parete cellulare: gli acidi micolici si complesserebbero infatti con la fucsina impedendone il rilascio nonostante il trattamento con alcool ed acido

23. Colorazione di Ziehl-NeelsenTecnica (1 di 2) Step 1: • Versare la fucsina basica Step 2: • Fare evaporare scaldando il colorante alla fiamma per 5 min • Lavare con acqua

24. Colorazione di Ziehl-NeelsenTecnica (2 di 2) Step 3: • Decolorare con alcool-acido fino alla scomparsa del colorante (circa 2 min) • Lavare con acqua Step 4: • Contrastare con blu di metilene per 1-2 min • Lavare con acqua

25. Colorazione di Ziehl-NeelsenOsservazione microscopica • Gli organismi acido-resistenti (AFB) appaiono colorati in rosso • Gli organismi non acido-resistenti risulteranno colorati in blu

26. Ziehl-Neelsen 1000x

27. ESAME COLTURALE • L’esame colturale per micobatteri presenta delle peculiarità, estranee alla batteriologia comune, legate alla lentezza con cui tali germi crescono sui terreni di coltura. • Il divario di ritmo moltiplicativo esistente fra i micobatteri e l’eventuale flora associata è infatti tale che la presenza di quest’ultima, sia pur costituita da specie non particolarmente invasive ed a carica microbica ridotta, finisce regolarmente con lo sfruttare completamente tutta la superficie di terreno a disposizione ben prima che le colonie dei micobatteri, ivi comprese anche le specie a crescita più rapida, possano raggiungere dimensioni tali da poter essere apprezzate. • La coltivazione dei micobatteri è possibile solo a condizione che questi si trovino in coltura pura (eventualità limitata in pratica solo a materiali particolari quali liquor, liquidi cavitari, sangue) o che a tale condizione possano essere ricondotti artificialmente (decontaminazione).

28. LA DECONTAMINAZIONEIl decontaminante ideale è una sostanza dotata di attività antibatterica su tutta la flora associata e del tutto priva di attività nei confronti dei micobatteri. a) NaOH al 4%. Può essere considerato il capostipite dei procedimenti di decontaminazione (svolge anche azione fluidificante); ormai non più usato a causa dell’elevata lesività sui micobatteri.b) H2SO4 al 4%. E’ eccessivamente lesivo per i micobatteri.c) Acido ossalico al 5%. Il suo impiego è giustificato solo per materiali fortemente contaminati da Pseudomonas aeruginosa essendo assai lesivo per i micobatteri.d) Fosfato trisodico al 25% + cloruro di benzalconio allo 0,3%. Decontamina e fluidifica al tempo stesso, la lesività sui micobatteri è ridotta e le contaminazioni risultano contenute.f) Fosfato trisodico allo 0,03% + NaOH allo 0,05% + di isobutil-naftalina-sulfonato allo 0,03%. L’attività decontaminante è molto buona, media la lesività sui micobatteri.

29. CARATTERISTICHE COLTURALI • velocità di crescita • aspetto delle colonie • rugose lisce • fotocromogene • scotocromogene • non pigmentate • crescita a varie temperature • test di inibizione selettiva

30. TERRENI SELETTIVI

31. Caratteristiche colturali

32. Caratteristiche delle colonie osservate con un microscopio da dissezione

33. METODI COLTURALI “ALTERNATIVI” • metodo radiometrico • terreno bifasico • terreno con indicatore fluorescente • terreno Redox

34. METODO RADIOMETRICO • flaconcini sigillati di terreno liquido contenente un substrato (ac. palmitico) marcato con 14C • miscela di antibiotici (PANTA) per il contenimento delle contaminazioni • liberazione di CO2 radiomarcata ad opera del metabolismo batterico • rilevamento di radioattività nella fase gassosa come spia di batteri metabolicamente attivi notevole accorciamento dei tempi di crescita maggior sensibilità

35. METODO RADIOMETRICO DI RICERCA DEI MICOBATTERI

36. TERRENO BIFASICO • flacone di terreno liquido per micobatteri • miscela di antibiotici (PANTA) per il contenimento delle contaminazioni • slide con vari tipi di terreni solidi (all'uovo, agarizzato, agar cioccolato) • arricchimento nel brodo e sviluppo di colonie isolate sul terreno solido moderato accorciamento dei tempi di crescita maggior sensibilità

37. TERRENO CON INDICATORE FLUORESCENTE • provetta di terreno liquido per micobatteri • miscela di antibiotici (PANTA) per il contenimento delle contaminazioni • fluorocromo, incorporato in un film di silicone sul fondo della provetta, sensibile alle variazioni del contenuto di ossigeno • comparsa di fluorescenza per effetto del consumo di ossigeno operato dal metabolismo batterico • rilevamento della fluorescenza • visivo, sotto una lampada UV • automatizzato accorciamento dei tempi di crescita maggior sensibilità

38. TERRENO REDOX • i micobatteri crescono nel terreno liquido di Kirchner formando piccoli fiocchi o intorbidamento uniforme • i sali di tetrazolio presenti nel terreno vengono ridotti a formazano dai micobatteri in crescita • il formazano, rosa-violetto ed insolubile, si fissa alla superficie delle colonie micobatteriche permettendone il riconoscimento

39. IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA • accumulo di niacina • riduzione dei nitrati • catalasi • quantitativa • termoresistente • idrolisi del Tween 80 • ureasi • arilsolfatasi • riduzione del tellurito

41. ANTIBIOGRAMMA • i farmaci antitubercolari maggiori • il principio del metodo delle proporzioni • l’antibiogramma manuale • l’antibiogramma automatizzato • l’antibiogramma sui micobatteri non tubercolari

42. ANTIBIOGRAMMA L’Antibiogramma dei Micobatteri viene eseguito in capsule di Petri a quadranti contenenti agar 7H11 • Un quadrante è usato come controllo, mentre ciascuno degli altri quadranti contiene un farmaco antimicrobico diverso • Tutti i quadranti vengono inoculati con una concentrazione standardizzata del microrganismo in esame • La sensibilità a ciascun farmaco è determinata paragonando il numero delle colonie cresciute nei quadranti contenenti i farmaci con il controllo (se la percentuale di resistenza è superiore all’1% il ceppo viene considerato resistente al farmaco)

43. ANTIBIOGRAMMA Antibiotico incorporato in dischetti di carta Antibiotico incorporato nell’agar

44. La diagnostica tradizionale • Esame microscopico • test rapido ma scarsamente sensibile • Esame colturale • sensibile ma richiede da una a otto settimane; problema delle contaminazioni • Identificazione • test biochimico-colturali: scarsa specificità, tempi lunghi • Antibiogramma • diretto: relativamente rapido ma con alta incidenza di contaminazioni • da ceppo isolato: tempi lunghi

45. Metodi di identificazione “alternativi” • DNA probe • HPLC degli acidi micolici • sequenziamento genico • 16S rDNA • SOD • HSP65

46. DNA-probe, alternativa all’identificazione? • Vantaggi • enorme risparmio di tempo • specificità pressoché assoluta • Svantaggi • disponibili per un numero limitato di specie • costo • complessità di esecuzione?

47. IDENTIFICAZIONE DEI MICOBATTERI MEDIANTE DNA-probes marcate con 125I

48. HPLC degli acidi micolici • acidi grassi, ramificati in posizione  • presenti nella parete batterica dei generi: • Corynebacterium: 22-38 atomi di C • Rhodococcus: 34-52 atomi di C • Nocardia: 44-60 atomi di C • Gordona: 48-66 atomi di C • Tsukamurella: 64-78 atomi di C • Mycobacterium: 60-90 atomi di C • presenza di numerosi gruppi funzionali che differenziano 7 tipi di acidi micolici micobatterici • alfa-, alfa'-, metossi-, keto-, epossi-, cere, omega' metossi-

49. HPLC degli acidi micolici • saponificazione, estrazione e derivatizzazione degli acidi micolici presenti nella parete dei micobatteri • frazionamento mediante HPLC • individuazione dei picchi presenti nel tracciato cromatografico e identificazione per confronto con profili di riferimento

50. profilo HPLC del M. tuberculosis complex • ad eccezione del M. bovis BCG SI