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Degradación aeróbica de tolueno: el plásmido TOL

Degradación aeróbica de tolueno: el plásmido TOL. Representative hydrocarbons in petroleum. Alkanes. n -alkane. Ramified alkane. Ciclics. Ciclopentane Ciclooctane Biciclooctan Ciclohexane Bicicloheptane. Aromatics.

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Degradación aeróbica de tolueno: el plásmido TOL

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  1. Degradación aeróbica de tolueno: el plásmido TOL

  2. Representative hydrocarbons in petroleum Alkanes n-alkane Ramified alkane Ciclics Ciclopentane Ciclooctane Biciclooctan Ciclohexane Bicicloheptane Aromatics Benzene Naphtalene Fenantrene Benzo (a) pirene

  3. DIFÍCILES DE DEGRADAR Hidrocarburos aromático: Representativos de contaminación (petróleo e industria) Estructuras muy estables Contaminantes antropogénicos Estructuras diseñadas para ser muy estables (Diseñadas para ser tóxicas)

  4. COMPUESTOS CONTAMINANTES DE ORIGEN INDUSTRIAL Orgánicos Pesticidas (concentraciones traza pero MUY tóxicos) Compuestos aromáticos policíclicos Hidrocarburos policlorados, solventes orgánicos y carburantes (BTEX) Solventes orgánicos NO clorados Tintes, detergentes, ... Inorgánicos Fosfatos y nitratos (agricultura intensiva) Metales tóxicos (Zn, Cd, Ni, Cu, Pb, Cr, Hg, Mo, As, Se)

  5. ORGANISMOS IMPLICADOS EN LA RECUPERACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS MICROORGANISMOS Bacterias Muy versátiles Buen nivel de conocimiento Fáciles de manipular Hongos Versátiles Bajo nivel de conocimiento de cepas silvestres Difíciles de manipular PLANTASGran tamaño (visibles) Manipulables INVERTEBRADOSComo reactores (futuro?)

  6. Manipulación requiere CONOCIMIENTO PREVIO • Organismos y sus posibilidades • Rutas disponibles • Regulación de la rutas • Mecanismos disponibles para su manipulación ¿Qué conocimiento tenemos? ¿Cómo llegamos esta información?

  7. C H 3 t o l u e n o Compuesto natural constituyente del petróleo (BTX) Origen antropogénico Clasificado como contaminante prioritario por la EPA Ejemplo mejor estudiado Compuesto modelo Conocimiento profundo a nivel bioquímico, genético, fisiológico, manipulación de rutas, circuitos reguladores, evolución, etc...

  8. tolueno CH3 Microorganismos capaces de crecer a expensas de compuestos aromáticos 1900 Microbiología "Ecología microbiana" 1930 Aislamiento e identificación de intermediarios 1940 Estudios exhaustivos de degradación de alquilaromáticos 1950 Bioquímica Oxidación de la cadena lateral del tolueno Oxidación del benceno vía catecol 1960 1as evidencias de una nueva ruta: rotura en meta Bioquímica de la degradación aeróbica de tolueno Plásmido TOL Pseudomonas putida mt-2 Aislada en los años 60

  9. C O O H CH3 C O O H Pseudomonas putida mt-2 Dos rutas diferentes para la degradación de benzoato: Rotura en orto (puede degradar BENZOATO) Rotura en meta (puede degradar METIL-BENZOATOS) Aparecen mutantes espontáneos que parecen cambiar su metabolismo de tipo meta a tipo orto. ben+, m-ben- Han perdido TODAS las enzimas de la ruta meta. Son MUY estables (no hay revertientes). Mismo fenotipo se obtiene curando con Mitomicina C El carácter el TRANSMISIBLE Los genes de la ruta meta presentes en un plásmido: TOL (pWW0)

  10. Métodos para el estudio de rutas • Detección e identificación de compuestos intermediarios (resting cells) • Estudios isotópicos • Estudios de adaptación simultánea • Obtención y análisis de mutantes

  11. TOL P. putida mt-2 TOD P. putida F1 TOM B. cepacia G4 TBU R. pickettii PK01 T4MO P. mendocina KR1

  12. CH3 AEROBIOSIS Intermediarios centrales Reacciones periféticas O H O H O H Activación del anillo catecol O H O O 2 2 O X I D A C I Ó N d e l a n i l l o C O O H R U P T U R A O X I G E N O L Í T I C A Apertura del anillo Oxidación O H C O O H O H p r o t o c a t e c u a t o H O C O O H O H C O O H g e n t i s a t o

  13. H O C H C O O H C H C H 3 2 C H N H 2 N C O O H H a n t r a c e n o L - t r i p t ó f a n o L - m a n d e l a t o t o l u e n o f e n a n t r e n o C O C O O H C H O H C O C H C H N H 2 2 2 C O O H C O O H N H C H O O H f o r m i l q u i n u r e n i n a a l c o h o l n a f t a l e n o b e n z o i l f o r m i a t o C H O b e n c í l i c o s a l i c i l a t o C O C H C H N H 2 2 b e n z a l d e h í d o C H C H C O O H C O O H N H 2 q u i n u r e n i n a C O O H C O O H c i n a m a t o b e n c e n o N H 2 N H O H 2 b e n z o a t o a n t r a n i l a t o f e n o l a n i l i n a O H O H C A T E C O L

  14. CH2OH CHO COOH CH3 Alcohol bencílico benzaldehído benzoato CH3 HOOC OH OH OH H xyleno DHDH CH3 OH Cis-benzoato dihidrodiol catecol P. putida mt-2 Ruta TOL XO DH DH tolueno T1,2DO Rotura en posición meta

  15. O2 O2 X F C1 C2 B A D E G I H S T NAD+ (todD) NADH+H+ CH 3 toluene ISPTOL NAD+ FerredoxinTOL ReductaseTOL (todC1C2) (todB) (todA) NADH+H+ FerredoxinTOL ReductaseTOL ISPTOL CH 3 H OH OH H cis-toluene dihydrodiol CH 3 OH OH 3-Methylcatechol (todE) Ring fission

  16. Orto No todos los sustituyentes están permitidos Meta

  17. C A T E C O L C H O C O O H C O O H C O O H O H Rotura del anillo: DIOXIGENASAS OH OH meta orto 2,3 Dioxigenasa 1,2 Dioxigenasa cis,cis-muconato Semiladhido hidroximucónico

  18. C H C O O H 3 O H O H M E T A O H O H c a t e c o l C H 3 3 - m e t i l c a t e c o l O O Catecol 2,3 Dioxiganasa 2 2 O H O H C O O H C O O H C H O C O H C O O H C H s e m i a l d e h í d o 2 - h i d r o x i m u c ó n i c o 3 2 - h i d r o x i , 6 - o x o s e m i a l d e h i d o s e m i a l d e h i d o 2 , 4 - h e p t a d i e n o a t o 2 - h i d r o x i m u c o n a t o 2 - h i d r o x i m u c o n a t o 2 - h i d r o x i , 6 - o x o d e s h i d r o g e n a s a O h i d r o l a s a 2 , 4 - h e p t a d i e n o a t o h i d r o l a s a C O O H O H 2 - o x o 4 - p e n t e n o a t o C O C O O H 2 C O O H 2 - h i d r o x i - 2 , 4 - p e n t a d i e n o a t o h i d r a t a s a 4 - o x a l c r o t o n a t o ( e n o l ) O H O 4 - o x a l c r o t o n a t o i s o m e r a s a C O O H 4 - o x a l c r o t o n a t o 4 - h i d r o x i - 2 - o x o v a l e r a t o d e s c a r b o x i l a s a 4 - h i d r o x i - 2 - o x o v a l e r a t o a l d o l a s a O C O O H + C H C O C O O H C H C H O C O O H 3 3 4 - o x a l c r o t o n a t o ( c e t o ) a c e t a l d e h í d o p i r u v a t o a c e t a l d e h í d o d e s h i d r o g e n a s a O C H C S C o A 3 a c e t i l C o A

  19. u c o n a t o g - c a r b o x i m u c o n o l a c t o n a d e s c a r b o x i l a s a O H H O O C O H O R T O O H O H c a t e c o l p r o t o c a t e c u a t o c a t e c o l 1 , 2 - d i o x i g e n a s a p r o t o c a t e c u a t o O O 2 2 3 , 4 - d i o x i g e n a s a H O O C C O O H C O O H C O O H C O O H b - c a r b o x i - - m u c o n a t o c i s , c i s - m u c o n a t o c i s , c i s b m u c o n a t o l a c t o n a s a - c a r b o x i m l a c t o n a s a H O O C C O O H C O O H O O O O g - c a r b o x i m u c o n o l a c t o n a m u c o n o l a c t o n a C O O H O m u c o n o l a c t o n a O i s o m e r a s a b - c e t o a d i p a t o e n o l l a c t o n a b - c e t o a d i p a t o e n o l l a c t o n a h i d r o l a s a O C O O H C O O H b - c e t o a d i p a t o b - c e t o a d i p a t o s u c c i n i l C o A t r a n s f e r a s a O C O S C o A C O O H b - c e t o a d i p i l C o A b - c e t o a d i p i l C o A t i o l a s a O O C S C o A H C C S C o A H O O C 3 a c e t i l C o A s u c c i n i l C o A

  20. CH3 CH3 CH3 OXIGENASAS Dioxigenasas  del anillo  Tolueno dioxigenasa  Benzoato dioxigenasa  (Metil)benzoato dioxigenasa (“toluate dioxygenase”)  abren el anillo  Catecol 1,2-dioxigenasa  Catecol 2,3-dioxigenasa  Protocatecuato 3,4-dioxigenasa Monoxigenasas  del anillo  Tolueno 2-monooxigenasa  Tolueno 3-monooxigenasa  Fenol hidroxilasa  Tolueno 4-monooxigenasa  4-hidroxibenzoato 3-hidroxilasa  de la cadena lateral  Xileno monooxigenasa

  21. O H O H O H Dioxigenasas del anillo Flavoproteína reductasa sulfoférrica C H 3 FAD o FMN Flavoproteína reductasa [2Fe-2S] Ferredoxina Rieske [2Fe-2S] Fe++ Oxigenasa NAD+ Compuesto aromático O2 + 2 H+ NADH+H+ C H H O O C O H 3 H H H Derivado dihidroxilado

  22. Dioxigenasas del anillo Clase Transporte de electrones Oxigenasa Ejemplo 4-sulfobenzoato 3,4-dioxigenasa FMN [2Fe-2S] 4-clorofenilacetato 3,4-dioxigenasa IA FMN [2Fe-2S] ftalato FMN 4,5-dioxigenasa [2Fe-2S] 2-oxo-1,2-dihidroquinolina FAD 8-monoxigenasa [2Fe-2S] IB benzoato FAD 1,2-dioxigenasa [2Fe-2S] dibenzofurano FAD IIA 4,4a-dioxigenasa benceno IIB FAD 1,2 dioxigenasa R naftaleno FAD III 1,2 dioxigenasa R [2Fe-2S] Reductasa Ferredoxina ISP ISP [2Fe-2S (mononuclear]

  23. A resaltar: Generalmente varias subunidades Cadena más o menos compleja de transporte de electrones. La reacción que llevan a cabo es similar. Especificidad de sustrato Sustratos metabolizados por la ruta TOL: tolueno, m-xyleno, p-xyleno, 3-etiltolueno, 1,2,4 trimetilbenzeno, ... Es una limitación, pero  es manipulable. “Rasgos” que identifican una ruta: Modo de activación del anillo Modo de rotura del anillo

  24. Protocatecuato 3,4-dioxigenasa (abFe3+)12 P. putida Ohlendorf et al., 1988

  25. Protocatecuato 3,4-dioxigenasa (abFe3+)12 P. putida Orville et al., 1997

  26. Catecol 2,3-dioxigenasa (aFe++)4 P. putida mt-2 Kita et al., 1999

  27. Catecol 1,2-dioxigenasa (aFe3+)2 Acinetobacter sp. ADP1 - catecol 4-metilcatecol Vetting & Ohlendorf, 1999

  28. Degradación anaeróbica de tolueno

  29. Introducción Catabolismo de hidrocarburos aromáticos se consideraba EXTRICTAMENTE dependiente de O2. En las rutas descritas, el ataque inicial del anillo requiere SIEMPRE O2 molecular (Mono- y Dioxigenasas). Últimos 10 años: algunos organismos TAMBIÉN puede degradar Hidrocarburos en ANAEROBIOSIS. Procesos anaerobios están empezando a mostrar un gran POTENCIAL para la solución de problemas de contaminación ambiental.

  30. Historia Observación: aromáticos NO se acumulan en la naturaleza en zonas anaerobias. 1985-86 El tolueno es degradado en sedimentos contaminados con hidrocarburos. 1990 Se consiguen los primeros cultivos puros. Tanto de zonas contaminadas como pristinas Están taxonómicamente relacionados

  31. Aerobio vs anaerobio Aerobios: Oxígeno cumple dos funciones: - Aceptor de electrones (RESPIRACIÓN) - Sustrato de las dioxigenasas Anaerobios: - Oxígeno puede sustituirse por OTROS ACEPTORES - La reactividad del O2 en Oxigenasas es INSUSTITUIBLE Estos organismos deben de haber desarrollado rutas diferentes, novedosas, independientes del oxígeno.

  32. Bacterias desnitrificantes : • C7H8 + 7.2 NO3- + 0.2 H+ 7 HCO3- + 3.6 N2 + 0.6 H2O • Gº’ = - 3554 kJ (mol tolueno)-1 • Bacterias reductoras de hierro (III) : • C7H8 + 94 Fe(OH)37 FeCO3 + 29 Fe3O4 + 145 H2O • Gº’ = -3398 kJ (mol tolueno)-1 • Bacterias sulfatoreductoras : C7H8 + 4.5 SO4= + 3 H2O 7 HCO-3 + 2.5 H+ +4.5 HS- Gº’ = -205 kJ (mol tolueno)-1 Reacciones estequiométricas de oxidación anaeróbica de tolueno acopladas a la reducción de diferentes aceptores de electrones.

  33. Cepas bacterianas disponibles en cultivo puro e identificadas Bacterias desnitrificantes (subclase  de proteobacterias) • Thauera aromatica K172 • Thauera aromatica T1 • Azoarcus sp. Cepa T. • Azoarcus tolulyticus Tol4 • Azoarcus tolulyticus Td15 • Bacterias reductoras de hierro (subclase  de proteobacterias) • Geobacter metallireducens GS15 • Bacterias sulfatoreductoras (subclase  de proteobacterias) • Desulfobacula toluolica Tol2 • Desulfobacterium cetonicum

  34. Elucidación de la ruta La activación del sustrato (tolueno) y la rotura en ausencia de O2 es similar en todas las cepas anerobias, independientemente del aceptor de electrones que utilice. ¿Cómo se activa el anillo? ¿Cómo es la apertura del anillo? Microbiología/ecología de anaerobios.

  35. C O O H O S C o A Métodos Estudios isotópicos (compuestos marcados con 13C o 14C). Detección e identificación de intermediarios Inhibodores metabólicos Análogos del tolueno Bajas temperaturas Limitación en aceptores de electrones Adaptación simultánea Análisis de mutantes En muchos cultivos, se observa acumulación transitoria de BENZOATO y/o BENZOIL-CoA CONFIRMACIÓN: aparece benzoil-CoA en Estudios in vitro con extractos crudos libres de células. Estudios in vivo con sustratos marcados

  36. C H 3 C C O O O O H H Se identifica BENCIL-SUCCINATO C C O O O O H H t o l u e n o C O O H b b e e n n c c i i l l s s u u c c c c i i n n a a t t o o H O O C f u m a r a t o Se propone el primer paso de la reacción: ADICIÓN DE FUMARATO Este compuesto se había considerado inicialmente un producto terminal no metabolizable (dead-end) Estudios cinéticos in vivo/in vitro apoyan la propuesta Se identifica la bencilsuccinato sintetasa

  37. B e n c i l s u c c i n a t o s i n t e t a s a S u c c i n i l C o A : b e n c i l s u c c i n a t o C o A - t r a n s f e r a s a C H 3 C O O H C O S C o A C O O H C O O H t o l u e n o C O O H s u c c i n i l C o A b e n c i l s u c c i n a t o b e n c i l s u c c i n i l C o A H O O C s u c c i n a t o f u m a r a t o B e n c i l s u c c i n i l C o A d e s h i d r o g e n a s a 2 [ H ] C O S C o A C O O H - f e n i l i t a c o n i l C o A E - f e n i l i t a c o n i l C o A E H O 2 h i d r a t a s a O S C o A s u c c i n i l C o A C 2 [ H ] O O H H S C o A C O S C o A C O S C o A C O O H C O O H b e n z o i l C o A 2 - c a r b o x i m e t i l 3 - h i d r o x i b e n z o i l s u c c i n i l C o A f e n i l p r o p i o n i l C o A 3 - o x o a c i l C o A t i o l a s a 3 - h i d r o x i a c i l C o A d e s h i d r o g e n a s a Thauera aromatica K172 No requiere ATP Se detecta E-fenilitaconilCoA Velocidad aumenta en presencia de succinilCoA como fuente de CoA Se detecta actividad SuccinilCoA:bencilsuccinato CoA-transferasa

  38. No se han detectado ni todos los intermediarios ni todas las reacciones. Pero cada vez hay más datos que apoyan esta ruta. Comprobado en detalle en Thauera y Azoarcus (desnitrificantes) Algunas de las reacciones se han identificados en bacterias sulforreductoras (muy distintas filogenéticamente). Mecanismo común a todas las cepas (?) Anillo activado(benzoilCoA) Rotura: en todos los casos, reacción hidrolítica. Es necesaria una reducción previa del anillo: BenzoilCoA Reductasa (requiere ATP; es MUY específica) Sigue -oxidación Las reacciones hasta la rotura del anillo están DEMOSTRADAS en Thauera y en Rhodopseudomonas

  39. 1 , 5 - c i c l o h e x a d i e n o 1 - c a r b o x i l 1 , 5 - c i c l o h e x a d i e n o 6 - h i d r o x i 1 - c i c l o h e x e n o 6 - c e t o 1 - c i c l o h e x e n o 1 - c a r b o x i l C o A 1 - c a r b o x i l C o A 1 - c a r b o x i l C o A S C o A O S C o A O C Rhodopseudomonas palustris C S C o A O C H O C O O H C O O H C H PimelilCoA 3 3 - h i d r o x i p i m e l i l C o A 2 [ H ] S C o A O S C o A O C C C O O H H O 2 2 [ H ] C H C O 2 [ H ] 3 2 C O S C o A 6 - h i d r o x i 1 - c i c l o h e x e n o 1 - c a r b o x i l C o A C o A h i d r a t a s a B e n z o i l C o A r e d u c t a s a d e s h i d r o g e n a s a S C o A O S C o A S C o A S C o A O O O C C C C 2 A T P 2 [ A D P + P ] H O + + N A D N A D H + H i 2 O b e n z o i l C o A 2 [ H ] 6 - c e t o 1 - c i c l o h e x e n o 2 H O 2 1 - c a r b o x i l C o A h i d r o l a s a 2 a c e t i l C o A 3 - h i d r o x i p i m e l i l C o A d e s h i d r o g e n a s a S C o A S C o A O O S C o A O C S C o A C O C O C O O H C O O H C O O H

  40. Activador (¿ORF?) Bencilsuccinato sintetasa a2b2g2 Muy sensible a O2 (V = 20 s) aa’b2g2

  41. BenzoilCoA reductasa Especificida de sustrato 2[4Fe-4S] Ferredoxina Fe/S FAD Benzoil CoA reductasa Donador de electrones? abgd

  42. O S C o A H C O O H C o - s u s t r a t o s a n a e r o b i o s : 2 [ H ] , C O , A T P , C o A , H O C O S C o A 2 2 I n t e r m e d i o s c e n t r a l e s ( a n a e r o b i o s ) b e n z o i l - C o A O 2 2 [ H ] 2 A T P A N A E R O B I O S I S O H O S C o A O H r e s o r c i n o l R E D U C C I Ó N d e l a n i l l o R U P T U R A H I D R O L Í T I C A O H C o A S H H O O H f l u o r o g l u c i n o l O H I n t e r m e d i o s c e n t r a l e s O O H 2 ( a e r o b i o s ) c a t e c o l O X I D A C I Ó N d e l a n i l l o C O O H O H R U P T U R A O X I G E N O L Í T I C A O H O H O A E R O B I O S I S 2 O H p r o t o c a t e c u a t o C O O H C O O H C O O H H O C o - s u s t r a t o s a e r o b i o s : O , H O O H 2 2 g e n t i s a t o

  43. H O C H C O O H C H C H 3 2 C H N H 2 N C O O H H a n t r a c e n o L - t r i p t ó f a n o L - m a n d e l a t o t o l u e n o f e n a n t r e n o C O C O O H C H O H C O C H C H N H 2 2 2 C O O H C O O H N H C H O O H f o r m i l q u i n u r e n i n a a l c o h o l n a f t a l e n o b e n z o i l f o r m i a t o C H O b e n c í l i c o s a l i c i l a t o C O C H C H N H 2 2 b e n z a l d e h í d o C H C H C O O H C O O H N H 2 q u i n u r e n i n a C O O H C O O H c i n a m a t o b e n c e n o N H 2 N H O H 2 b e n z o a t o a n t r a n i l a t o f e n o l a n i l i n a O H O H C A T E C O L

  44. C O O H C H 3 b e n z o a t o t o l u e n o C H C O O H C O O H C O O H C H O H 3 2 C H N H 2 C H C O O H C H O C H O H C H 3 2 O H O H O H O C H O H 3 H N C H C O O H 2 - c r e s o l p a l c o h o l v a i n i l l a t o p r o t o c a t e c u a t o N f e n o l C H - m e t o x i b e n c í l i c o p 2 O H H t r i p t ó f a n o c u m a r a t o C O O H f e n i l a l a n i n a N H 2 C O O H N H C O O H C H O H 2 2 H N C H C O O H a n i l i n a 2 C H 2 - a m i n o 2 b e n z o a t o C O O H C l O H a l c o h o l 3 - c l o r o b e n z o a t o C O - h i d r o x i b e n z o a t o b e n c í l i c o p O S C o A O H C t i r o s i n a O S C o A O S C o A f e n i l - o x o a c e t a t o C C N H 2 N H 2 - a m i n o b e n z o i l C o A o O H - h i d r o x i b e n z o i l C o A p O S C o A C B E N Z O I L C o A

  45. Características generales de cepas anaerobias que degradan tolueno Tanto estrictas como facultativas. Espectro de hidrocarburos aromáticos que son capaces de degradar es MUY REDUCIDO. tg generalmente mayor que en aerobios. (desnitrificantes son las que tienen velocidad de crecimiento mayor) Muchas formas de respiración.

  46. Identificación de GENES Mutagénesis al azar - química - transposones  SELECCIÓN de clones inactivos secuenciación (cromosoma) Genoteca - Complementación - Búsqueda de actividades Confirmación - producto génico - Comparación con proteína conocida Análisis de secuencia

  47. Aplicaciones Gran potencial para la solución de problemas de contaminación medioambiental. Zonas contaminadas con frecuencia son ANAEROBIAS. OXIGENACIÓN  $$ TRANSPORTE  no es considerable en áreas grandes. Considerar recuperación in situ basada en organismos ANAEROBIOS. Adición de otros aceptores de electrones, más solubles (fácil y barato). Degradación lenta Aplicable cuando la contaminación sólo afecta al suelo (no hay acuífero amenazado).

  48. Estimaciones energéticas potenciales Oxígeno disuelto en agua saturada: 8,6 mg/l Esto permitiría oxidar 2,8 mg tolueno/l Concentración saturante de sulfato en agua: 2 g/l Esto permitiría oxidar (anaeróbicamente) 300 mg tolueno/l Pero Procesos aerobios son mucho más RÁPIDOS. Organismos aerobios son más versátiles.

  49. Zona no saturada NR MnR O2 contaminante contaminante aeróbico O2 Accidente! Tiempo NR MnR O2 FeR SR contaminante Acuíferos

  50. CO2 CO2 O2 SO4= S= NO3- N2 Zona no saturada SO4= NO3- contaminante O2 M CO2 O2 Fe(III) Fe(II) CO2 CH4 NR CO2 SR O2 H2O FeR

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