PCR 原理 , 應用和 Troubleshooting

1. PCR 原理,應用和Troubleshooting 業務部：江俊奇

2. PCR的歷史 • PCR這項技術是在1985年由凱利·穆利斯(Kary B. Mullis)發明，並因此在七年之後，1993年10月，獲得了諾貝爾化學獎該項殊榮。穆利斯的想法是，利用一種人工方法，和反覆相同程序的方法，並利用一種特殊的酶—DNA聚合酶來擴增特定的DNA片段。 • Taq DNA聚合酶是一種高耐熱性的酵素，一九六九年發現於美國黃石國家公園溫泉的嗜熱細菌Thermus aquaticus之中。七0年代中期，陽明大學神經科學研究所的錢嘉韻教授於美國愛荷華州立大學攻讀博士學位時，首度從Thermus aquaticus純化出來這種高耐熱性的DNA聚合酶。

3. 何謂PCR • The Polymerase Chain Reaction is a method for making many copies of a specific segment of DNA, starting with a very small amount. • 簡單地說，聚合酶鏈鎖反應是運用一種具高耐熱性質的DNA聚合酶（thermostable DNA polymerase）在一對高特異性的引子（primers）引導下，在短時間內於體外或試管內(In Vitro)大幅增量某一特定之DNA序列（target sequence）的分子生物學技術

4. PCR 基本要件 • DNA模板(template)：含有需要擴增的DNA片斷，雙股螺旋DNA經高溫解離成單股DNA，作為PCR反應的模版。 • 2個引子(primer)：包括了前置引子(forward primer)和反置引子(reverse primer)，決定了需要擴增的起始和終止位置。功能就像衛星導航一樣，能找到目標基因片段的頭、尾兩端。 • DNA聚合酶(polymerase)：複製需要擴增的區域。能將4種核酸原料（dNTPs：dATP、dGTP、dCTP、dTTP）依照DNA模板密碼，正確地一個一個地加上去，而合成新的ㄧ股基因片段。 • 脫氧單核苷酸(dNTP)：用於構造新的互補鏈。 • 氯化鎂(MgCl2) ：可提供鎂離子作為聚合酶的輔因子，輔助聚合酶作用。 • 緩衝體系(Buffer) ：提供適合聚合酶行使功能的化學環境，主要是由Tris、KCl所調配成的緩衝液，pH 約8.4。

5. PCR 反應過程 • Initial denaturation ：利用高溫（94℃ ~95℃）將雙股螺旋DNA 解離成單股DNA ，該步驟時間1-2分鐘。 • Denaturation：利用高溫（90~95℃）將雙股螺旋DNA 解離成單股DNA，再以單股DNA作為複製的模板。該步驟時間1-2分鐘。 • Annealing：溫度降低到適當溫度，讓引子黏結到正確的目標基因位置。此階段的溫度通常低於引子熔點5℃。錯誤的黏合溫度可能導致引子不與模板結合或者錯誤地結合。該步驟時間20-40秒 • Extension：溫度調整到72℃，鎂離子作為酵素輔因子，讓DNA聚合脢依照模板上的密碼，開始將核酸原料（dNTPs）一個接著一個的加上去，合成另一股新DNA 片段。該步驟時間依賴於聚合酶以及需要合成的DNA片斷長度。大概估計合成1000bp需要1分鐘。

6. PCR Condition

7. PCR Procedure • Initialization step: This step consists of heating the reaction to a temperature of 94-96°C (or 98°C if extremely thermostable polymerases are used), which is held for 1-9 minutes. • Denature step: This step is the first regular cycling event and consists of heating the reaction to 94-98°C for 20-30 seconds. • Annealing step: The reaction temperature is lowered to 50-65°C for 20-40 seconds Typically the annealing temperature is about 3-5 degrees Celsius below the Tm of the primers used. • Extension/elongation step: The temperature at this step depends on the DNA polymerase used; Taq polymerase has its optimum activity temperature at 75-80°C,[8][9] and commonly a temperature of 72°C is used with this enzyme. the DNA polymerase will polymerize a thousand bases in one minute. • Cycle number: 25-40 cycles • Final elongation: This single step is occasionally performed at a temperature of 70-74°C for 5-15 minutes after the last PCR cycle to ensure that any remaining single-stranded DNA is fully extended. • Final hold: This step at 4-15°C for an indefinite time may be employed for short-term storage of the reaction.

8. PCR 的各種變體 • 遞減PCR( touchdown PCR)：前幾循環溫度逐漸下降。 • 逆轉錄PCR(RT-PCR)：將目標細胞內的RNA逆轉錄為DNA，再進行聚合酶反應，這是一種分析細胞內RNA表現的方法之一。 • 即時PCR(real-time PCR)：PCR過程中利用熒光探針或染料半定量檢測，又稱定量PCR(quantitative PCR)。 • 巢式PCR(nested PCR)：先用低特異性引子擴增幾個循環以增加模板數量，再用高特異性引子擴增。 • 多重PCR(multiplex PCR)：在同一個管中使用多組引子。

9. PCR 的應用 • 基因圖譜建立 • 親子鑑定 • 偵測遺傳疾病 • 克隆基因 • 基因突變研究 • DNA遺傳演化 • 基因表現比較

10. PCR troubleshooting *The 10x PCR buffer contains: 500 mM KCl; 100 mM Tris-HCl (pH 8.3); 15 mM MgCl2 (the final concentrations of these ingredients in the PCR mix are: 50 mM KCl; 10 mM Tris-HCl; 1.5 mM MgCl2).

11. PCR 常見問題 Q假陰性，不出現擴增條帶 A模板：模板中含有雜蛋白質，模板中含有Taq酶抑制劑，模板中蛋白質沒有消化除凈 • 酶：失活或量不夠 。 • 引子：引子品質(設計)、引子的濃度、兩條引子的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。 • Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。 • 降低annealing temperature by 6-10º C

12. PCR 常見問題 Q.假陽性，出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。 A.引子設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性 ,Target序列太短或引子太短，容易出現假陽性。 Target序列或擴增產物的交叉污染： 一是整個基因組或大片段的交叉污染 二是空氣中的小片段核酸污染

13. PCR 常見問題 Q.出現非特異性擴增帶  • PCR擴增後出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現， A.原因：一是引子與靶序列不完全互補、或引子聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、annealing temperature過低，及PCR cycle次數過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現，酶量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有：必要時重新設計引物。減低酶量或調換另一來源的酶。降低引子量，適當增加模板量，減少cycle數。適當提高annealing temperature或採用二溫度點法(93℃變性，65℃左右annealing與extension)。

14. PCR 常見問題 4.出現片狀拖帶或塗抹帶 • PCR擴增有時出現塗抹帶或片狀帶或地毯樣。 A.其原因往往由於酶量過多或酶的品質差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，annealing temperature過低，cycle數過多引起。其對策有：減少酶量，或調換另一來源的酶。減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃度。增加模板量，減少cycle數。

15. Real time PCR(Q-PCR) • Real-time PCR 或稱Quantitative PCR (Q-PCR)是一種藉著PCR操作協助定量DNA or RNA (進行RT-PCR) 濃度的方法。 • Real-time PCR跟傳統PCR不同之處在於前者可經由光學系統去監測反應中產物量(螢光物質)的變化而反應在電腦上，後者則必須等反應結束後再進行洋菜膠體電泳分析。 • 目前Real-time PCR螢光系統可大致分為「非探針型」及「探針型」。

16. Real time PCR分型 • (一)「非探針型」的系統就是在反應中加入會與雙股DNA嵌合而釋放出螢光的物質，目前最常被使用的螢光染劑是SYBR-green I，這種物質會嵌入在雙股DNA的小凹槽(minor groove)而釋放出可被偵測的螢光，所以當PCR產物越多時，嵌入的SYBR-green I就越多，釋放出的螢光也就越多。 • (二)「探針型」系統相對上就較為複雜，反應中除了要有專一性的引子對之外，另外還要在引子對之間DNA序列中找到具有專一性的片段來作為探針，如果不是目標物種來做偵測，探針就不會雜合到核酸上，之後也就不會釋放出螢光而被偵測到，所以「探針型」系統的專一性也就相對比較高。主要又分為Hydrolysis probe (TaqMan system) & Molecular Beacon

17. Hydrolysis probe (TaqMan system)

18. Molecular Beacon

33. 結論: PCR除了是一個診斷工具外，更重要的是它有廣泛的運用。人類在邁入廿一世紀中即將出現若干的突破，生物醫學便是其中重要的一項。在過去三、四十年耒，像PCR這樣影響深遠的技術實在很難找到。它的震撼, 除了眾多的得獎外(包括諾貝爾獎),更在於它的可塑性、修飾性及全方位的運用。未來的生物醫學領域中，它也必定繼續扮演舉足輕重的角色。期許大家，也許在不久的未來，下一個震驚全世界的生物技術就是由你發明的喔。

34. Thanks for your attention