STTA Ames mutagenitási vizsgálat In vivo mikronukleusz

1. STTAAmes mutagenitási vizsgálatIn vivo mikronukleusz Tarnóczai Tímea tarnoczai.timea@okbi.antsz.hu 2012. 11. 27.

2. Mutációk • Mindig genetikai eredetű (környezeti vagy endogén hatás) • Minél több mutáció jön létre, annál nagyobb a rák kialakulásának valószínűsége • Sok vegyi anyag kis dózisban mutagén, nagy dózisban citotoxikus→genotoxikus anyagok

3. Tautomerizáció

4. Mutagén tényezők • Fizikai tényezők: ionizáló és nem-ionizáló sugárzás • Ionizáló: rövid hullámhossz, atomokat ionokká alakítja→vízből szabadgyökök keletkeznek→intenzív oxidáció • Determinisztikus (küszöbdózis) és sztochasztikus hatás (vagy kialakul, vagy nem, dózissal nő a valószínűség) • Nem-ionizáló: hosszú hullámhossz (pl. UV, timin dimerizáció)

5. kémiai tényezők: • hatásmechanizmusok alapján lehetnek: bázisanalógok interkaláló vegyületek(gyűrűs szerkezetű anyagok, beépülnek) alkiláló vegyületek deamináló vegyületek szabadgyököt képező vegyületek nehézfémek DNS-szintézis inhibitorok Bázisanalógok: A természetes bázisokhoz hasonló szerkezetűek, a DNS polimeráz beépíti a kettős spirálba pl. 5-brómuracil (5BU) : timin analóg adeninnel és guaninnal is képes párosodni, tranzíciót okoz

6. Deamináló szerek: indukált deaminációt okoz pl. salétromossav citozin→uracil, mely a következő replikáció során adeninnel párosodik és C-G > T-A tranzíciót okoz

7. Alkiláló szerek: alkil (-CH3, -CH2-CH3) csoportokat építenek a nukleinsavak bázisaira és azokat módosítják pl.etil-metánszulfonát (EMS) főként a guanint, kisebb mértékben a timint módosítja • a 6-etilguanin timinnel párosodik, ami C-G>T-A tranzíciót eredményez • a 4-etil-timin a guaninnal párosodik, és így T-A>C-G tranzíció jön létre

8. Vegyiparban használt köztes és végtermékek: epoxidok etilén-iminek acetaldehid Akrilaldehid propán szulfon Dimetil-szulfát Dietil-szulfát dimetil-nitrózamin hidrazinok uretán Etilén-klorid Vinil-klorid élelmiszeradalékok: nitritek, nitrátok nátriumbisziulfit ciklohexamin kozmetikumok: hajfesték (nitrofenilén-diamin) H2O2 femnilén-diamin diaminotoluol diaminoanizol gyógyszerek: citosztatikumok altató és nyugtató szer fertőtlenítőszerek (formaldehid, H2O2) növényvédőszerek, herbicidek, insecticidek: klórozott szénhidrogének szerves-foszforsav észterek karbamidok, karbamátok, ftálamidok, szerves higanyvegyületek Környezeti mutagén anyagok Levegőszennyezés: policiklikus aromás szénhidrogének Szervetlen mikroszennyezők: nehézfémek azbeszt Szerves mikroszennyezők: gomba és baktériumok által termelt toxinok

9. STTA (stable transfected transcriptional activation assay) • Endokrin diszruptorok azonosítására • OECD 455 guideline • Hormonreceptorok citoplazmában • Szubsztrát kötődés • Dimerizáció és aktiválódás • Receptor-ligand komplex DNS promóterhez kötődik→transzkripció aktiválása

10. STTA assay-ben: • hERα-HeLa-9903 sejtvonal • Legrégebbi humán sejtvonal • Méhnyakrákból származik (Henrietta Lacks) • HeLa genetikailag módosított változata→ ösztrogén reszponzív elemek, ösztrogén receptor

11. DNS-ben szintetikus promóter kötőhellyel • Promóter után luciferáz gén→hormon hatású anyag kötődése esetén átíródik • Szubsztrát (luciferin) hozzáadása • Fény szabadul fel, amit mérni lehet (luminométer) • Minél nagyobb a fény aktivitása, annál nagyobb a hormonreceptor hatás (1 μM határig) • Pozitív és negatív referencia anyagok (határokon belül!) • Pozitív és negatív kontroll

12. Full length of hER dimerizáció ligandum citoplazma HR sejtmag luciferáz 5’ 3’ ERE hER Luciferin- luciferáz reakcó 5’ vegyület 3’ luciferáz ERE fény Luciferáz aktivitás 0 10-9 M 10-12 10-10 10-11 HR: Hormon Receptor hER: humán ösztrogén receptor ERE:Estrogen-Responsive Element

13. Bakteriális reverz mutagenitási vizsgálat • Bruce Ames 1970-es évek elején • Pontmutációt okozó kémiai anyagok észlelésére alkalmas (genetikai betegségek) • Prokarióta sejtek • Aminosav szintetizáló képesség károsodott • Öröklött génmutáció reverziója • A kémiai anyag által okozott mutáció ezt a képességet állítja vissza (back mutáció) • Minél több mutációt okoz egy anyag, annál valószínűbb, hogy pont az a triplet mutálódik

14. Különbözik az emlőssejtektől (metabolizmus, kémiai anyagok felvétele, kromoszómaszerkezet) Metabolikus aktivizálás kívülről Citokróm P450 oxidációs rendszer (májban) S9 mikroszóma frakció + NADP + kofaktorok Enzim termelődésének növelése→inducer Nem mindig alkalmazható (baktericid vegyületek) Spontán módon is visszafordulhat a mutáció (spontán revertánsok-negatív kontroll)

15. Teszttörzsek • Escherichia coli és Salmonella typhimurium • E. coli triptofán mutáns (WP2 uvrA), S. typhimurium hisztidin mutáns (TA98, TA100, TA1535, TA1537) • Mutációk a hisztidin és triptofán operon különböző részén (más-más törzsek) • Back mutáció hatására aminosav hiányában is nőnek • Negatív és pozitív kontroll kell

16. Egyéb genetikai módosítások • Cél az érzékenység növelése • Rfa mutáció: nagy molekulasúlyú anyagok bejutása • uvrA/uvrB mutáció: DNS javító mechanizmus mutációja • pKM101 plazmid: Kémiai és UV-besugárzás szembeni érzékenység növelése, ampicillin rezisztencia • Törzsek ellenőrzése szükséges

17. Előinkubációs és lemezöntéses módszer • Speciális anyagoknál módosítások

18. A vizsgálat menete • 10 órás szuszpenziós tenyészet készítése • Másnap kémcsőben tenyészet + puffer + kontroll vegyület/teszt anyag + top agar • Minimál agaros Petri-csészére önteni • Top agar megszilárdulása • Inkubálás 48-72 óráig 37°C-on • Előinkubáció esetén top agar nélküli keverék inkubálása (előinkubáció ideje 20-40 perc) • Telepszámolás, mikroszkópos értékelés • Eredmények értékelése (szignifikáns emelkedés/statisztikai értékelés)

19. Aminosav igény ellenőrzése (minimál agar) Ampicillin rezisztencia, kristályibolya- és UV-érzékenység (tápagar) Spontán mutáció (negatív kontroll) Indukált mutáció (pozitív kontroll)

20. Negatív kontroll, normál baktériumpázsit 25μg/lemez glutáraldehid toxikus hatása

21. Ames II. • módosított Ames vizsgálat • 96 v. 384 lyukú mikrotiter lemez • TA 98 (frameshift) és TAMix (6 törzs, bázispár szubsz.) • baktériumok és teszt anyag + hisztidin = savas közeg, melyet a pH indikátor festék érzékel (lilából sárgába vált) • automatizált, kisebb mennyiség is elég

22. In vivo mikronukleusz • Genotoxikus károsodás vizsgálata eritrocitákon • Kromoszómakárosodás következtében kialakuló mikronukleusz megléte • Mikronukleusz: membránnal határolt teljes kr. vagy kr. darab • Emlős csontvelőben vagy perifériális vérben • OECD Guideline 474 (a) a mikronukleusz acentrikus kromoszóma fragmensből származik (b) a mikronukleusz egész kromoszómát tartalmaz

23. A csontvelőben történik az vörösvérsejtek érése Normocita→polikromáziás eritrocita fejlődés során a mag kipréselődik a sejtből Ha keletkezett mikronukleusz, azt az polikromáziás eritrocitában láthatjuk A mikronukleusszal rendelkező eritrocitaszám emelkedés megemelkedett kromoszómális károsodásra utal

24. Állatok kezelése subcutan (bőr alatt) vagy per os (szájon át) • Kontroll (negatív és pozitív) és kezelt csoport • Megfelelő oldószer kiválasztása: ne legyen toxikus, ne lépjen reakcióba a tesztanyaggal • Kezelés egyszer→leölés és csontvelő kivétele (24 és 48 órával a kezelés után) • Perifériális vérminta esetén vérvétel kétszer (36 és 72 órával a kezelés után) • Femur preparálás→csontvelő fötális borjúsavóba→centrifugálás→kenetkészítés

25. Kenetkészítés után festés (May-Grünwald és Giemsa) Polikromáziás eritrocita mikronukleusszal és anélkül Normocita Egy polikromáziás eritrocita az érett eritrociták között

26. Értékelés mikroszkóppal • Először polikromáziás eritrocita (PCE)/normocita(NCE) arány meghatározása (100 db PCE leszámolás) • 2000 PCE közül mennyiben van mikronukleusz • PCE/NCE arány 0,1 felett kell legyen • A vizsgálat végén az alább adatokra lesz szükség: MPCE/2000 PCE, NCE/ 100 PCE, PCE/NCE arány • Statisztikai értékelés