basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie

1. basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie Deel 2 door Peter Roels Monitoraat Wetenschappen K.U. Leuven

2. basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie • DNA-dubbelhelix • inleiding: 3 pijlers • restrictiefragment-lengtepolymorfisme • Southern-vlektechniek • genkloning • polymerase-kettingreactie • DNA-sequentiebepaling

3. DNA-dubbelhelix DENATURATIESTAP 92°C enkelstrengs DNA RENATURATIESTAP 40-60°C enkelstrengs DNA + primer 5’...ATTCGCTCGCAATATAGATCTC 3’ 3’ GCGTTATATCTCGAG 5’ polymerase-kettingreactie

4. DNA-dubbelhelix DENATURATIESTAP 92°C enkelstrengs DNA RENATURATIESTAP 40-60°C enkelstrengs DNA + primer POLYMERISATIESTAP 72°C bijna voltooide DNA- dubbelhelices polymerase-kettingreactie

5. 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ nieuwe streng 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ polymerase-kettingreactie 3’ 5’ 5’ 3’

6. 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ nieuwe streng 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ polymerase-kettingreactie 3’ 5’ 5’ 3’

7. polymerase-kettingreactie

8. polymerase-kettingreactie

9. polymerase-kettingreactie

10. polymerase-kettingreactie

11. polymerase-kettingreactie

12. binding temperatuur 5’ …GCGGTGCAAG… 3’ geen 50°C 3’ CACGT 5’ specifiek 5’ …GCGGTGCAAG… 3’ 45°C 3’ CACGT 5’ aspecifiek 5’ …GCGGTGCAAG… 3’ 40°C 3’CACGT 5’ polymerase-kettingreactie:meer over primers…

13. 5’ …GCGATGCAAG… 3’ 5’ …GCGGTGCGAG… 3’ 5’ …GCGGTGCAAG… 3’ polymerisatie complementair 3’ CACGT 5’ 3’ CACGT 5’ 3’ CACGT 5’ niet complementair aan 3’-einde primer geen polymerisatie niet complementair aan 5’-einde primer polymerisatie polymerase-kettingreactie:meer over primers…

14. PCR versus celkloning

15. PCR versus celkloning

16. basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie • DNA-dubbelhelix • inleiding: 3 pijlers • restrictiefragment-lengtepolymorfisme • Southern-vlektechniek • genkloning • polymerase-kettingreactie • DNA-sequentiebepaling

17. stop A stop C stop G stop T DNA-sequentiebepaling: reacties 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’

18. stop A 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ stop A DNA-sequentiebepaling: reacties + polymerase nucleotiden (A, C, G, T*) primer (5’ ACCG 3’) stopnucleotide A

19. 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 5’ACCG 3’ 5’ACCG 3’ 5’ACCG 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ACCG 3’ 5’ACCG 3’ 5’ACCG 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ stop A TGACGA TGA TGACGAT

20. 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 5’ACCG 3’ 5’ACCG 3’ 5’ACCG 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ stop A 5’ACCG 3’ 5’ACCG 3’ TGACGA TGA 5’ACCG 3’ TGACGAT

21. stop A DNA-sequentiebepaling: reacties

22. stop A stop C stop G stop T stop A stop C stop G stop T - + stop A stop C stop G stop T DNA-sequentiebepaling: elektroforese

23. 5’ACCGT DNA-sequentiebepaling: interpretatie stop A stop C stop G stop T

24. DNA-sequentiebepaling: interpretatie 5’ ACCGTG stop A stop C stop G stop T

25. DNA-sequentiebepaling: interpretatie 5’ ACCGTGA stop A stop C stop G stop T

26. DNA-sequentiebepaling: interpretatie 5’ACCGTGAC stop A stop C stop G stop T

27. DNA-sequentiebepaling: interpretatie 5’ ACCGTGACG stop A stop C stop G stop T

28. DNA-sequentiebepaling: interpretatie 5’ACCGTGACGA stop A stop C stop G stop T

29. DNA-sequentiebepaling: interpretatie 5’ACCGTGACGA? 3’ stop A stop C stop G stop T

30. DNA-sequentiebepaling: interpretatie 5’ ACCGTGACGA? 3’ 3’ TGGCACTGCT? 5’ stop A stop C stop G stop T

31. DNA-sequentiebepaling:cycle sequencing simulatie http://www.dnalc.org/resources/BiologyAnimationLibrary.htm

32. DNA-sequentiebepaling:cycle sequencing