320 likes | 441 Views
basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie. Deel 2. door Peter Roels Monitoraat Wetenschappen K.U. Leuven. basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie. DNA-dubbelhelix inleiding: 3 pijlers restrictiefragment-lengtepolymorfisme Southern-vlektechniek genkloning
E N D
basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie Deel 2 door Peter Roels Monitoraat Wetenschappen K.U. Leuven
basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie • DNA-dubbelhelix • inleiding: 3 pijlers • restrictiefragment-lengtepolymorfisme • Southern-vlektechniek • genkloning • polymerase-kettingreactie • DNA-sequentiebepaling
DNA-dubbelhelix DENATURATIESTAP 92°C enkelstrengs DNA RENATURATIESTAP 40-60°C enkelstrengs DNA + primer 5’...ATTCGCTCGCAATATAGATCTC 3’ 3’ GCGTTATATCTCGAG 5’ polymerase-kettingreactie
DNA-dubbelhelix DENATURATIESTAP 92°C enkelstrengs DNA RENATURATIESTAP 40-60°C enkelstrengs DNA + primer POLYMERISATIESTAP 72°C bijna voltooide DNA- dubbelhelices polymerase-kettingreactie
3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ nieuwe streng 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ polymerase-kettingreactie 3’ 5’ 5’ 3’
3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ nieuwe streng 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ polymerase-kettingreactie 3’ 5’ 5’ 3’
binding temperatuur 5’ …GCGGTGCAAG… 3’ geen 50°C 3’ CACGT 5’ specifiek 5’ …GCGGTGCAAG… 3’ 45°C 3’ CACGT 5’ aspecifiek 5’ …GCGGTGCAAG… 3’ 40°C 3’CACGT 5’ polymerase-kettingreactie:meer over primers…
5’ …GCGATGCAAG… 3’ 5’ …GCGGTGCGAG… 3’ 5’ …GCGGTGCAAG… 3’ polymerisatie complementair 3’ CACGT 5’ 3’ CACGT 5’ 3’ CACGT 5’ niet complementair aan 3’-einde primer geen polymerisatie niet complementair aan 5’-einde primer polymerisatie polymerase-kettingreactie:meer over primers…
basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie • DNA-dubbelhelix • inleiding: 3 pijlers • restrictiefragment-lengtepolymorfisme • Southern-vlektechniek • genkloning • polymerase-kettingreactie • DNA-sequentiebepaling
stop A stop C stop G stop T DNA-sequentiebepaling: reacties 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’
stop A 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ stop A DNA-sequentiebepaling: reacties + polymerase nucleotiden (A, C, G, T*) primer (5’ ACCG 3’) stopnucleotide A
5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 5’ACCG 3’ 5’ACCG 3’ 5’ACCG 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ACCG 3’ 5’ACCG 3’ 5’ACCG 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ stop A TGACGA TGA TGACGAT
5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 5’ACCG 3’ 5’ACCG 3’ 5’ACCG 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ stop A 5’ACCG 3’ 5’ACCG 3’ TGACGA TGA 5’ACCG 3’ TGACGAT
stop A DNA-sequentiebepaling: reacties
stop A stop C stop G stop T stop A stop C stop G stop T - + stop A stop C stop G stop T DNA-sequentiebepaling: elektroforese
5’ACCGT DNA-sequentiebepaling: interpretatie stop A stop C stop G stop T
DNA-sequentiebepaling: interpretatie 5’ ACCGTG stop A stop C stop G stop T
DNA-sequentiebepaling: interpretatie 5’ ACCGTGA stop A stop C stop G stop T
DNA-sequentiebepaling: interpretatie 5’ACCGTGAC stop A stop C stop G stop T
DNA-sequentiebepaling: interpretatie 5’ ACCGTGACG stop A stop C stop G stop T
DNA-sequentiebepaling: interpretatie 5’ACCGTGACGA stop A stop C stop G stop T
DNA-sequentiebepaling: interpretatie 5’ACCGTGACGA? 3’ stop A stop C stop G stop T
DNA-sequentiebepaling: interpretatie 5’ ACCGTGACGA? 3’ 3’ TGGCACTGCT? 5’ stop A stop C stop G stop T
DNA-sequentiebepaling:cycle sequencing simulatie http://www.dnalc.org/resources/BiologyAnimationLibrary.htm