1 / 47

basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie

basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie. Deel 1. door Peter Roels Monitoraat Wetenschappen K.U. Leuven. basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie. DNA-dubbelhelix inleiding: 3 pijlers restrictiefragment-lengtepolymorfisme Southern-vlektechniek genkloning

richelle-lucas
Download Presentation

basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie Deel 1 door Peter Roels Monitoraat Wetenschappen K.U. Leuven

  2. basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie • DNA-dubbelhelix • inleiding: 3 pijlers • restrictiefragment-lengtepolymorfisme • Southern-vlektechniek • genkloning • polymerase-kettingreactie • DNA-sequentiebepaling DNA! Natuurlijk, maar...

  3. basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie • DNA-dubbelhelix • inleiding: 3 pijlers • restrictiefragment-lengtepolymorfisme • Southern-vlektechniek • genkloning • polymerase-kettingreactie • DNA-sequentiebepaling DNA! Natuurlijk, maar...

  4. DNA-dubbelhelix DNA! Natuurlijk, maar...

  5. DNA-dubbelhelix 5’ TGA 3’ 3’ ACT 5’ DNA! Natuurlijk, maar...

  6. basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie • DNA-dubbelhelix • inleiding: 3 pijlers • restrictiefragment-lengtepolymorfisme • Southern-vlektechniek • genkloning • polymerase-kettingreactie • DNA-sequentiebepaling DNA! Natuurlijk, maar...

  7. 3 pijlers in derecombinant-DNA-technologie • complementaire basenparing • restrictie-enzym of restrictie-endonuclease • DNA-polymerase DNA! Natuurlijk, maar...

  8. complementaire basenparing steeds: adenine – thymine (2 H-bruggen) guanine – cytosine (3 H-bruggen) van groot belang in biologische werking, o.a.: • DNA-replicatie • RNA-synthese cruciaal in vele technieken! DNA! Natuurlijk, maar...

  9. absorbantie es DNA DENATURATIE ds DNA temperatuur complementaire basenparing DNA! Natuurlijk, maar...

  10. absorbantie Ts temperatuur complementaire basenparing DNA! Natuurlijk, maar...

  11. GC-gehalte absorbantie <Ts < Ts Ts temperatuur complementaire basenparing DNA! Natuurlijk, maar...

  12. absorbantie temperatuur complementaire basenparing es DNA RENATURATIE ds DNA DNA! Natuurlijk, maar...

  13. complementaire basenparing • ook tussen niet perfect complementaire strengen is renaturatie (hybridisatie) mogelijk • algemene regel: - smelttemperatuur van deze dubbelhelix lager naarmate aantal complementaire basen afneemt - hoe meer de strengen complementair aan elkaar, hoe hoger de temperatuur van het medium vóór denaturatie DNA! Natuurlijk, maar...

  14. restrictie-enzymen • herkent en knipt welbepaalde sequentie van nucleotiden (4 tot 8 bp) • herkenningssequentie is palindroom 5’...GAATTC...3’ 3’...CTTAAG...5’ DNA! Natuurlijk, maar...

  15. ...G AATTC... ...CTTAA G... restrictie-enzymen • herkent en knipt welbepaalde sequentie van nucleotiden (4 tot 8 bp) • herkenningssequentie is palindroom vaak met vorming “kleverige eindjes” 5’...GAATTC...3’ 3’...CTTAAG...5’ DNA! Natuurlijk, maar...

  16. DNA-polymerase • maakt vanaf aparte nucleotiden DNA-streng aan op enkelstrengse matrijs • steeds dubbelstrengs DNA nodig als start • steeds aangroei nieuwe DNA-streng aan 3’-uiteinde 3’...CTTAAG... 5’ 5’...GA 3’ DNA! Natuurlijk, maar...

  17. DNA-polymerase • maakt vanaf aparte nucleotiden DNA-streng aan op enkelstrengse matrijs • steeds dubbelstrengs DNA nodig als start • steeds aangroei nieuwe DNA-streng aan 3’-uiteinde 3’...CTTAAG... 5’ 5’...GA 3’ ATTC... DNA! Natuurlijk, maar...

  18. basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie • DNA-dubbelhelix • inleiding: 3 pijlers • restrictiefragment-lengtepolymorfisme • Southern-vlektechniek • genkloning • polymerase-kettingreactie • DNA-sequentiebepaling DNA! Natuurlijk, maar...

  19. restrictiefragment-lengtepolymorfisme (RFLP) • digestie van DNA met restrictie-enzym DNA! Natuurlijk, maar...

  20. restrictiefragment-lengtepolymorfisme (RFLP) • digestie van DNA met restrictie-enzym DNA! Natuurlijk, maar...

  21. restrictiefragment-lengtepolymorfisme (RFLP) • digestie van DNA met restrictie-enzym DNA! Natuurlijk, maar...

  22. restrictiefragment-lengtepolymorfisme (RFLP) • digestie van DNA met restrictie-enzym • gelelektroforese (met agarosegel) DNA! Natuurlijk, maar...

  23. gelelektroforese: opzet stalen 1 2 3  DNA! Natuurlijk, maar...

  24. gelelektroforese: opzet stalen 1 2 3  DNA! Natuurlijk, maar...

  25. gelelektroforese: spanning - + DNA! Natuurlijk, maar...

  26. gelelektroforese: spanning - + DNA! Natuurlijk, maar...

  27. gelelektroforese: spanning - + DNA! Natuurlijk, maar...

  28. 1000 500 300 200 100 gelelektroforese: visualisatie - + DNA! Natuurlijk, maar...

  29. gelelektroforese: visualisatie - + DNA! Natuurlijk, maar...

  30. restrictiefragment-lengtepolymorfisme (RFLP) • digestie van DNA met restrictie-enzym • gelelektroforese (met agarosegel) • interpretatie DNA! Natuurlijk, maar...

  31. gelelektroforese: interpretatie 1 2 3  400 50 DNA! Natuurlijk, maar...

  32. 5’…CAATT 3’ 3’…G 5’ 5’…CAATTG…3’ 3’…GTTAAC…5’ 5’…CAACTG…3’ 3’…GTTGAC…5’ 5’ G…3’ 3’ TTAAC…5’ gelelektroforese: interpretatie 1 2 3  400 50 DNA! Natuurlijk, maar...

  33. gelelektroforese: interpretatie 1 2 3  400 50 DNA! Natuurlijk, maar...

  34. 5’…CGGTCTAGGTG…3’ 3’…GCCAGATCCAC…5’ 5’…CGGGGTG…3’ 3’…GCCCCAC…5’ gelelektroforese: interpretatie 1 2 3  400 50 5’…CGGTCTAGGTG…3’ 3’…GCCAGATCCAC…5’ DNA! Natuurlijk, maar...

  35. gelelektroforese: interpretatie 1 2 3  400 50 DNA! Natuurlijk, maar...

  36. gelelektroforese: interpretatie 1 2 3  400 50 DNA! Natuurlijk, maar...

  37. resultaat na digestie van totaal genomisch DNA 1 2 3  400 50 DNA! Natuurlijk, maar...

  38. basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie • DNA-dubbelhelix • inleiding: 3 pijlers • restrictiefragment-lengtepolymorfisme • Southern-vlektechniek • genkloning • polymerase-kettingreactie • DNA-sequentiebepaling DNA! Natuurlijk, maar...

  39. agarosegel nylondrager autoradiogram 5’…AACTCAGCTG … 3’ blotting + sonde radiografie 5’ … AACTC 3’ 3’ GAGTCG 5’ 5’ AGCTG … 3’ 3’ GAGTCG 5’ Southern-vlektechniek 3’ GAGTCG 5’ DNA! Natuurlijk, maar...

  40. Southern-vlektechniek:afkomst sonde (probe) • uit gekende aminozuursequentie van eiwit (degeneratie code!) • uit mRNA, na omzetting in cDNA • sonde gebruikt in een ander, verwant organisme (voldoende complementair!) DNA! Natuurlijk, maar...

  41. basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie • DNA-dubbelhelix • inleiding: 3 pijlers • restrictiefragment-lengtepolymorfisme • Southern-vlektechniek • genkloning • polymerase-kettingreactie • DNA-sequentiebepaling DNA! Natuurlijk, maar...

  42. 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ lacZ-gen (enzym katalyseert omzetting “X-gal” naar blauwe kleurstof) ampicillineresistentiegen genkloningspecifieke amplicatie van DNA-fragment pUC18 DNA! Natuurlijk, maar...

  43. 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ genkloningspecifieke amplicatie van DNA-fragment 5’ GAATTC GAATTC 3’ 3’ CTTAAG CTTAAG 5’ DNA! Natuurlijk, maar...

  44. 5’ GAATTC GAATTC3’ 3’ CTTAAG CTTAAG5’ 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG genkloningspecifieke amplicatie van DNA-fragment DNA! Natuurlijk, maar...

  45. + ampicilline + X-gal bacterie – plasmide = niet-AB-resistent plasmide zonder donor-DNA = blauw genkloningspecifieke amplicatie van DNA-fragment DNA! Natuurlijk, maar...

  46. blotting radiografie genkloningspecifieke amplicatie van DNA-fragment DNA! Natuurlijk, maar...

  47. genkloningspecifieke amplicatie van DNA-fragment DNA! Natuurlijk, maar...

More Related