• 520 likes • 1.4k Views
Potranslacyjne modyfikacje bia łek. Podział nieformalny Nieodwracalne modyfikacje warunkujące natywną, funkcjonalną strukturę białka (np. przyłączenie hemu do łańcuchów białkowych hemoglobiny, hydroksylacja proliny i lizyny prokolagenu)
E N D
Potranslacyjne modyfikacje białek • Podział nieformalny • Nieodwracalne modyfikacje warunkujące natywną, funkcjonalną strukturę białka (np. przyłączenie hemu do łańcuchów białkowych hemoglobiny, hydroksylacja proliny i lizyny prokolagenu) • Odwracalne modyfikacje regulujące aktywność czy funkcję białka (np. fosforylacja, acetylacja) • Nieodwracalne modyfikacje warunkujące degradację białka (poliubikwitynacja) Znanych jest kilkadziesiąt różnych potranslacyjnych modyfikacji białek
GLIKOZYLACJA • Dwie grupy związków powstających w wyniku przyłączania reszt cukrowych do białek: • GLIKOPROTEINY PROTEOGLIKANY • łańcuchy cukrowe przyłączone • poprzez wiązanie O-glikozydowe • łańcuchy cukrowe przyłączone • poprzez wiązanie N-glikozydowe: • złożone • wysokomannozowe • hybrydowe
PROTEOGLIKANY • Proteoglikany występują głównie w macierzy zewnątrzkomórkowej (głównie w obrębie tkanki łącznej). Są produkowane przez fibroblasty, osteoblasty, chondroblasty itp. • MACIERZ ZEWNĄTRZKOMÓRKOWA: • GLIKOZOAMINOGLIKANY (GAG) • PROTEOGLIKANY:BIAŁKO + GAG • BIAŁKA FIBRYLARNE: • strukturalne: np. kolagen, elastyna • adhezyjne: laminina, fibronektyna, • witronektyna
GLIKOZOAMINOGLIKANY (GAG) • Nierozgałęzione łańcuchy cukrowe złożone z powtarzających siędisacharydów. • Jednym z nich jest zawsze aminocukier: • N-acetylo-glukozoamina lub N-acetylo- galaktozoamina. • Drugim cukrem jest zwykle kwas uronowy (glukuronowy lub iduronowy). • Kwas iduronowy: pochodny idozy; idoza nie występuje w naturze. Kwas iduronowy różni się od glukuronowego izomerią przy C5. fragment siarczanu chondroityny
Wyróżniamy 4 grupy GAG (biorąc pod uwagę: reszty cukrowe, typ wiązania, ilość i ułożenie reszt siarczanowych: Hialuronian(kwas glukuronowy i N-AcGlu, nie ma reszt siarczanowych) Siarczan chondroityny(kwas glukuronowy i N-AcGal) i siarczan dermatanu (kwas iduronowy i siarczan N-AcGal) Siarczan heparanu i heparyna (D-glukozoamina (lub kwas iduronowy) i N-AcGlc) Siarczan keratanu (D-galaktoza i N-AcGlu) Duża gęstośćładunków ujemnych przyciąga Na+, co powoduje napływ wody – tworzy się galaretka o bardzo wysokim turgorze – ogromna wytrzymałość na nacisk (setki tysięcy hPa).Ilość GAG w tkance łącznej stanowi 10% masy białek fibrylarnych, ale zajmuje większość przestrzeni.
SYNTEZA PROTEOGLIKANÓW • Odbywa się w aparacie Golgiego • Najpierw dołączany jest tetrasacharyd (ksyloza-gal-gal-kwas glukuronowy) do reszty seryny a następnie łańcuch cukrowy rośnie w wyniku dodawania po jednej reszcie przezglikozylotransferazy. • Dołączone reszty cukrowe mogą ulegać epimeryzacji a także ulegają reakcji sulfonowania. Dołączane reszty siarczanowe zwiększają ujemny ładunek cząsteczek.
Porównanie glikoprotein i proteoglikanów • Glikoproteiny: 1 – 60% masy stanowią cukry (rozgałęzione struktury) • Proteoglikany – nawet > 95% masy stanowią cukry (proste łańcuchy o ok. 80 resztach cukrowych, 70 - 200) • Mogą mieć od 1 – 10 GAG albo bardzo dużo GAG nawet 100 • Część białkowa proteoglikanów może być mała albo duża: 10 kDa do 600 kDa Przykłady: Aggrekan – proteoglikan chrząstki: 2000 kDa (część białkowa – 250 kDa, 40łańcuchów GAG Dekoryna – 1 łańcuch GAG
www.uku.fi/laitokset/ anat/PG/aggregaa.jpg Naczynia krwionośne siatkówki Na niebiesko – NG2, proteoglikan pericytów www.theschepens.org/nvbresearchimages.htm
GLIKOPROTEINY • łańcuchy cukrowe przyłączonepoprzez wiązanie O-glikozydowe • łańcuchy cukrowe przyłączone • poprzez wiązanie N-glikozydowe: • złożone • wysokomannozowe • hybrydowe
Glikoproteiny o wiązaniu • O-glikozydowym • wiązanie następuje przez resztęSer lub Thr • reszty cukrowe dodawane są kolejno przez glikozylotransferazy w aparacie Golgiego • łańcuchy cukrowe są krótkie: • 2-10 reszt • pierwszą (przyłączoną do aminokwasu resztą) jest zwykle • N-acetylogalaktozoamina (N-AcGal) • występują w mucynach i w białkach błon komórkowych
oligosacharyd mucyny ślinianek oligosacharyd sjaloglikoproteiny błon erytrocytów Fragment N-końowy glikoforyny A SSTTEVAMHTSTSSVTKSYISSETSDKHKWDTYPATPRAHEVSEIYVTTV.................. Na czerwono zaznaczono aminokwasy, do których przyłączone są oligosacharydy.
Typy łańcuchów cukrowych występujących w N-glikoproteinach Połączenie z białkiem – przez resztę Asn
Fosforan dolicholu jest akceptorem reszt cukrowych a następnie donorem struktury oligosacharydowej w syntezie N-glikoprotein
Przeniesienie łańcucha cukrowego z cytoplazmy do światła siateczki śródplazmatycznej. Enzym nazwano flipazą. Oligosascharide translocation protein RFT1 Udział RFT-1 (ang. Requiring Fifty Three protein-1) u drożdży podany ostatnio w wątpliwość Białko o 13 transbłonowych fragmentach; występuje w błonie siateczki w dość dużych ilościach. U człowieka występuje homolog tego białka.
GLIKOZYLOTRANSFERAZY Wszystkie glikozylotransferazy, które wykorzystują jako substrat połączenia cukier-fosforan dolicholu są silnie hydrofobowe. Są białkami błonowymi o kilku domenach transmembranowych o m.cz. 60-75 kDa. Charakteryzują się bardzo wysoką specyficznością substratową. Dwie różne N-acetyloglukozoaminotransferazy przenosząreszty N-acetyloglukozoaminy na fosforan dolicholu. Dwie różne mannozylotransferazy dołączają reszty mannozy po cytoplazmatycznej stronie. Trzy różne mannozylotransferazy dołączają reszty mannozy w świetle ER. Są to: a-1,2 mannozylotransferaza a-1,3 mannozylotransferaza 1,6 mannozylotransferaza Trzy różne glukozylotransferazy dołączają reszty glukozy w świetle ER
Transferaza oligosacharydowa przenosi łańcuch cukrowy z fosforanu dolicholu na resztę asparaginy łańcucha białkowego • OST – kompleks transferazy oligosacharydowej: • OST48 • ryboforyna I • ryboforyna II • DAD1 (defender of apoptotic cell death) • STT3A/STT3B • N33/IAP • OST4
OST - transferaza N-oligosacharydowa • 10- 30% potencjalnych sekwencji glikozylacji • NIE JEST GLIKOZYLOWANYCH • Co decyduje: • Być może struktura II-rzędowa (nie znajduje jak na razie potwierdzenia). • Aminokwasy w najbliższym otoczeniu sekwencji: Pro, gdy znajduje się tuż za sekwencją, hamuje glikozylację. Trp, Asp, Glu też hamują. • Sekwencja Asn-X-Thr jest 40x lepszym substratem niż Asn-X-Ser (to jest mniej widoczne in vivo). • Sekwencje blisko C-końca są mniej chętnie glikozylowane – być może przeszkodą jest już zwinięty łańcuch? • Ciekawostka: może tak być, że jeśli się zmutuje resztęAsn normalnie glikozylowaną, to glikozylacji ulegnie następna reszta Asn w sekwencji Asn-X-Thr (Ser), która normalnie nie jest glikozylowana.
Glukozydaza I (92 kDa) białko transmembranowe typu II, usuwa jedną reszte glukozy. Glukozydaza II (ab, 104 i 58 kDa) białko rozpuszczalne; łańcuch a zawiera centrum aktywne. Brak homologii między glukozydazą I i II.
Kalneksyna i kalretikulina • Kalneksyna i kalretikulina są białkami opiekuńczymi glikoprotein w ER • Kalneksyna (65 kDa) – białko transmembranowe typu I, • Kalretikulina (46 kDa) jest rozpuszczalnym homologiem kalneksyny. • Są lektynami - wiążą się specyficznie z monoglukozowymi częściami cukrowymi glikoprotein. Nie wiążą takich oligosacharydów, które mają 2, 3 lub 0 reszt glukozy.
Specyficzność substratowa kalneksyny i kalretikuliny: • wiążą bardzo wiele glikoproteinpoprzez oddziaływanie z resztami cukrowymi, ale w pewnych przypadkach sugeruje się ich oddziaływanie także z częściami białkowymi. • większość zbadanych białek może oddziaływać zarówno z kalneksyną jak i kalretikuliną. Ale są wyjątki. • kalneksyna i kalretikulina wiążą wapń. Wiązanie wapnia wpływa na ich funkcje białek opiekuńczych.
Glukozylotransferaza UDP-glukoza: glikoproteina rozpuszczalny enzym – 170 kDa, C-koniec homologiczny do innych glukozylotransferaz prawdopodobnie zawiera centrum katalityczne ENZYM NIEZWYKŁY! ROZPOZNAJE JEDYNIE BIAŁKA NIENATYWNE (o błędnej strukturze) I MODYFIKUJE JE KOWALENCYJNIE Jeśli glikoproteiny nie są zwinięte lub są zwinięte nieprawidłowo – podlegają działaniu glukozylotransferazy i są przyłączane do kalneksyny lub kalretikuliny są zatrzymywane w ER.
Współdziałanie kalneksyny (kalretikuliny) z glukozydazą II i glukozylotransferazą nieprawidłowo zwinięte prawidłowo zwinięte (natywne)
Co się dzieje, jeśli białko nie jest w stanie przyjąć prawidłowej konformacji? J. Biol. Chem. 2001; 276 (14), zdjęcie z okładki
szlak przemian skierowujący do lizosomów
Czy glikozylacja białek zachodzi jedynie w ER? Pojawia się coraz więcej doniesień o występowaniu glikoprotein (zarówno N-glikoprotein jak i O-glikoprotein) w cytoplazmie i w jądrze komórkowym. Essentials of Glycobiology, 2nd edition, 2009 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=glyco2
Rearanżacja mostków disiarczkowych a b b a sekwencja –Cys-Gly-Pro-Cys- sekwencja –Cys-Gly-His-Cys- sekwencja wiążąca wapń
Tioredoksyna jest małym białkiem - 12 kDa • Razem z reduktazą tioredoksyny i NADPH uczestniczy w redukcji mostków disiarczkowych w białkach jak np. • enzymy cyklu Calvina • reduktaza rybonukleotydowa (enzym przekształcający difosforanyrybonukleozydóww difosforanydeoksyrybonukleozydów).
PDI protein disulfide isomerase (PDI występują tylko w ER; nie występują w cytoplazmie) • W odróżnieniu od tioredoksyny PDI jest faktycznym enzymem. • Jej substratami są białka posiadające reszty cysteiny, i wg niektórych doniesieńistotne są również oddziaływania hydrofobowe, a więc PDI preferencyjnie oddziałuje z niezwiniętymi białkami. Miejsce wiązania substratu lokalizuje się przede wszystkim w drugiej domenie beta. • PDI przyspiesza rearanżację mostków ok. 6000 razy. U bakterii w periplazmie występuje homolog PDI – DsbA
Inne funkcje PDI PDI pełni również inne funkcje – funkcje istotne dla dojrzewania białek, ale nie wiadomo do końca czy związane z jej aktywnością redox (raczej nie). Enzym P4H (2a2b) (prolyl 4-hydroxylase) to enzym ER katalizujący hydroksylację proliny w łańcuchu prokolagenu. Podjednostki beta = PDI. Jaka jest tu funkcja PDI – albo stabilizacja kompleksu enzymatycznego albo redukcja askorbinianu – kofaktora tego enzymu (sprzeczne doniesienia) PDI stanowi także podjednostkę beta innego heterodimerycznego enzymu - MTTP(microsomal triglyceride transfer protein), który odpowiada za inkorporację triacyloglicerydów do lipoprotein.
Działanie izomerazy peptydylo-prolilowej (takie enzymy występują i w cytoplazmie i w ER) wiązanie X - prolina