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Introducción a la espectroscopía vibracional . . Conceptos básicos Estados vibracionales y energía Modos normales de vibración frecuencia de vibraciones . Técnicas Espectroscopía infrarroja Regiones del IR Grupos funcionales "Huellas digitales" Número de ondas e intensidad
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Introducción a la espectroscopía vibracional • .Conceptos básicos • Estados vibracionales y energía • Modos normales de vibración • frecuencia de vibraciones • .Técnicas • Espectroscopía infrarroja • Regiones del IR • Grupos funcionales • "Huellas digitales" • Número de ondas e intensidad • Reglas de selección • FTIR y sus ventajas • Espectroscopía Raman • Dispersión inelástica de fotones (Stokes y anti-Stokes) • Reglas de selección • Ventajas sobre el IR • Resonanacia Raman • .Aplicaciones a proteínas • Análisis de estructura secundaria • Cálculos • Asignaciones • Uso de isótopos • Grupos laterales
Bibliografía • Campbell, I.D. and Dwek, R.A.; Biological Spectroscopy; Benjamin Cummings (1984) • Cantor, C.R. and Schimmel, P.R.; Biophysical Chemistry; Vol 2, (1984). • Krimm, S and Jagdeesh Bandekar, Vibrational Spectroscopy and Conformation of Peptides, Polypeptides and Proteins; Adv. Prot Chem. 38; (1986), p. 180 • Susi, H and Byler, D.M.; Resolution Enhanced Fourier Transform Infrared Spectroscopy of Enzymes; Methods in Enzymology; 130, p 290 • Williams, R.W.; Protein Secondary Structure Analysis Using Raman Amide I and Amide III Spectra; Methods in Enzymology; 130, p 311
Introducción a la espectroscopía vibracional Espectro electromagnético
Estados vibracionales y energía Frecuencia de la vibración k = constante de fuerza del enlace F = -kx µ = masa reducida, para un sistema diatómico
O O C O O O O C C O O C Modos normales de vibración (3N - 5)
Técnicas: INFRARROJO Reglas de selección: No todas las vibraciones serán “activas” en IR Sólo aquellas en las que cambie el momento dipolar permanente durante la vibración
INFRARROJO N-H C-H C=O
FTIREspectrometría IR con Transformada de Fourier • Mejor relación señal/ruido ya que la luz no debe pasar por un monocromador. • Se miden todas las frecuencias a la vez lo que da mucha mayor rapidez • Puede tener una resolución de menos de 0.01 cm-1 • Los espectros pasan necesariamente por una computadora lo que facilita el análisis y manejo espectral
C H C N O C Modos normales de vibración del grupo amida (valores para metilacetamida) amida II (1567 F) amida III (1299 M) estiramiento NH (3236 F) amida I (1653 F) amida VI (600 M) amida VII (206 M) amida IV (627 D) amida V (725 F) estiramiento NC (1096 D) estiramiento CN y CC (881 D) deformación CCN (436 D) deformación CNC (289 D)
Estructura secundaria ovillo estadístico hélice a transición a b b antiparalela Susi, H., Timasheff, S and Stevens, L. J Biol Chem (1967)242, 5460-5466
Estructura secundaria Estructura a Estructura b Goormaghtigh, E; Ruysschaert, J. M. and Raussens, V Biophysical Journal Volume 90 April 2006 2946–2957
Porcentajes de hélice y cadena extendida obtenidas por rayos X y FTIR
Uso de isótopos 1H2O 2H2O Efecto de la deuteración de la proteína sobre la posición de la banda amida I J. Biol. Chem. (1998) 273: 771-777
Uso de isótopos Asignación tentativa de las diferentes bandas en el espectro FTIR de BIAP y apoBIAP en 2H2O, pH 6.6
Uso de isótopos 1 = 27 min 2 = 63 min 3 = 180 min 4 = 21 h Efecto del tiempo en la deuteración de tripsina en 2H2O a 25º C, pD = 3.1 Eur. J. Biochem. 48, 339-344 (1974)
Isótopos y posición de las bandas FTIR de monóxido de carbono unido a citocromo c aa3 de T. termophilus. Referencia: Pinakoulaki, E.; Soulimane, T. and Varotsis, C. (2002) J. Biol. Chem.277:32867.
estados electrónicos virtuales Técnicas: Raman Dispersión inelástica de fotones Sir Chandrasekhara Venkata Raman, (சந்திரசேகர வெங்கடராமன்) Tiruchirapalli, Tamil Nadu -7/11/1888 Bangalore, Karnataka - 21/11/1970 Premio Nobel de Física 1930
muestra Láser, luz monocromática Regla de selección: Para que la vibración sea activa en Raman debe provocar un cambio en la polarizabilidad de la molécula. Monocromador, espectrógrafo • Ventajas de Raman con respecto a IR • Se mide en el visible o el UV donde los detectores son mucho más sensibles • El agua produce una dispersión Raman muy débil • La resonancia Raman permite sondear grupos asociados a cromóforos con una sensibilidad 102- 104 veces mayor
N N
Resonancia Raman estado electrónico excitado estado energético virtual Resonancia Raman Raman estado electrónico basal La resonancia Raman es más intensa que la dispersión Raman, pero necesita que exista un cromóforo y sólo se intensifican las bandas debidas al cromóforo
l = 406.7 nm Das, T. K., S. Mazumdar and S. Mitra (1998). Eur J Biochem254(3): 662-70
[hemo] = 0.34 mM [SO42-] = 400 mM SO42- Spiro, T. C. and Strekas, T. G. (1973) JACS 96: 338
Uso de isótopos Unión de óxido nítrico a superóxido reductasa de Pyrococcus furiosus l = 476 nm
Espectro IR de BSA sólida (azul) y espectro Raman de BSA en solución en amortiguador de fosfato (rojo).
El fenómeno de absorción es más intenso por lo que se requieren muestras menores El equipamiento es más sencillo y de uso más flexible No presenta interferencias con otros fenómenos físicos (p. ej. fluorescencia) Se mide en el visible o UV donde los detectores son mucho más sensibles El agua produce una dispersión Raman muy débil El Raman resonante permite sondear grupos asociados a cromóforos con una sensibilidad varios órdenes de magnitud mayor Infrarrojo y Raman
Introducción a la espectroscopía vibracional • .Conceptos básicos • Estados vibracionales y energía • Modos normales de vibración • frecuencia de vibraciones • .Técnicas • Espectroscopía infrarroja • Regiones del IR • Grupos funcionales • "Huellas digitales" • Número de ondas e intensidad • Reglas de selección • FTIR y sus ventajas • Espectroscopía Raman • Dispersión inelástica de fotones (Stokes y anti-Stokes) • Reglas de selección • Ventajas sobre el IR • Resonanacia Raman • .Aplicaciones a proteínas • Análisis de estructura secundaria • Cálculos • Asignaciones • Uso de isótopos • Grupos laterales