생체시료분석 역량강화를 위한 Workshop

1. 생체시료분석 역량강화를 위한 Workshop 2012. 8. 11. 이 종 성

2. 생체시료분석검사학?? • 인간의 경제활동 (노동시간, 근로환경, 유해인자 노출) 작업환경으로 인한 질병발생 가능 • 작업환경에서의 유해인자 노출량 평가 (Environmental, Biological monitoring) • 유해인자의생체내재용량(internal-dose)을 평가하는 것이 생물학적노출지표검사 • 어떻게 분석?? (유해인자별 생체지표 종류, 분석방법, 분석기기 operating) • 분석장비 : Spectrophotometer, HPLC, IC, GC, AAS, ICP…. • 유해인자 생체노출지표이외의 기기분석법 응용?

3. 1. 작업환경측정과 생물학적 노출지표검사 작업환경측정은 1) 근로자의 호흡기 위치에서 공기를 채취 2) 실제 근로자가 흡수한 유해물질량과 차이존재 3) 흡입된 물질은 개인의 대사기전 차이로 인해 독성의 정도가 다름 4) 호흡기 이외의 노출량 평가 곤란 생체노출지표검사는 이러한 작업환경측정의 단점을 보완하여 혈액, 소변, 모발 등 생체시료로부터 유해물질 그 자체, 유해물질의 대사물질, 생화학적 변화산물 등 생물학적노출지표(물질)를 분석하여 유해물질 노출에 의한 체내 흡수정도 또는 건강영향 가능성 등을 평가하는 것

4. 제 1상 반응 (Phase I reaction) 제 2상 반응 (Phase II reaction) 기능단 추가 2차 대사물질 (secondary product) 외인성 화학물질 (xenobiotic) 1차 대사물질 (primary product) Oxidation Reduction Hydrolysis Conjugation 배설 (excretion) 친지질성 (Lipophilic) 친수성 (Hydrophilc) ※ 독성물질의 대사시 제1단계 반응(phase I reaction)과 제2단계 반응(phase II reaction)

5. 2. 유해물질 노출평가(작업환경측정) ○ 산업위생관리(산업위생, 작업환경관리 및 측정, 산업환기 등)의 궁극적 목적: 산업장에서 유해화학물질의 노출로부터 발생될 수 있는 건강상의 장해를 예방하는 것 ○ 수단 : 현재의 근로자 노출수준을 허용기준과 비교함으로써 노출로 인해 생길 수 있는 건강상의 위험성을 정기적으로 평가 ○ 그러나,오랫동안 근로자의 건강에 대한 위험성의 평가는 작업환경중의 유해물질을 모니터링하는 작업환경측정을 통해 수행되고 있음

6. 3.작업환경측정의 단점(생물학적노출지표검사의 필요성) • 근로자는 동일한 공정이라도 유해화학물질의 농도, 작업상황, 조건 등이 잘 통제된 상태에 노출된 동일노출그룹(homogeneous exposure group)이라고 할 수 있는 경우가 드물다. • 근로자들은 서로 나이, 영양상태, 신체적인 상태 등이 달라 동일한 노출에서도 건강상의 영향이 다르게 나타날 수 있다. • 작업특성이나 개인적인 위생습관에 따라 노출되는 경로가 호흡기뿐만 아니라 피부, 소화기를 통해서 노출이 된다. • 공기 중에 존재하는 유해화학물질이 동일한 농도라 할지라도 흡수(absorption), 생체변환(biotransformation), 제거(elimination)에서의 차이로 인해 결국 활동부위에 도달하는 활성대사산물에서 차이가 근로자마다 나타난다.

7. 유해물질의 산업보건관리 시스템

8. Biologicalmonitoring

9. 1. Biological Monitoring 장점 ○ 건강상의 위험을 보다 직접적으로 평가할 수 있음 - 생물학적노출지표는 인체 내에 흡수된 양이거나, 중요한 조직부위에 영향을 미치는 양이므로 건강상의 영향과 보다 직접적으로 관련이 있음 ○ 생물학적인 모니터링은 모든 경로에 의한 종합적인 노출을 평가할 수 있음 - 환경모니터링이 주로 호흡기에 의한 흡수경로만을 평가하는 반면, 경구 및 피부흡수 등 모든 경로에 대한 노출량 평가 가능 ○ 작업강도, 운동량에 의한 섭취량의 증가를 반영 - 안정시의 폐포환기량: 5 L/min - 보통의 운동에너지를 부하시킨 경우 폐포환기량: 16 L/min ○ 흡수이전의 폭로 정도에 대한 정보를 얻을 수 있음 - 반감기가 긴 물질 ○ 예방조치들의 실효성 여부를 평가 ○ 준노출위험군(At-Risk Sub-population)을 인식할 수 있 - 거주지역(고속도로변등), 식습관, 생활습관(흡연유무등), 지형적 영향에 따른 준노출위험군에 대한 인식이 가능

10. 2. Biological Monitoring 단점 ○ 생물학적 시료의 취급, 저장 및 분석의 어려움 ○ 건강상의 영향과 생물학적 변수와의 상관성을 구명하기가 어려움

11. 3. 생물학적 노출지표검사에서 유의해야 할 점 가. 실시시기 ○ 정상작업이 이루어지고 있을 때 실시 ○ 가능한 작업환경측정 시점과 동일한 시점에 생물학적 노출지표검사를 실시  개인별 노출량 평가 자료로서 작업환경 측정 자료와 함께 건강진단에 활용 나. 시료채취시기 ○ 생물학적 노출지표검사를 할 때는 해당 물질의 생체 내 배설 반감기의 차이를 고려하여 정해진 시료 채취시기를 따라야 한다. - 수시 : 하루 중 아무 때나 시료를 채취 가능 - 당일 : 당일 작업 종료 2시간 전부터 직후까지, - 주말 : 목요일이나 금요일 또는 4-5일간의 연속작업의 작업 종료 2시간 전후 - 작업시작 전 (prior to shift) : 화학물질에 마지막으로 노출된 지 16시간 후 - 작업 후 (end of shift, EOS) : 작업종료 전 2시간 전후(반감기 5시간 이내) - 주중 작업의 종료 (end of weekend) : 4-5일 동안 계속 노출된 후 - 수시 : 배설 반감기가 매우 길고, 체내에 수년 또는 평생 동안 축적되는물질

12. - 배출이 빠르고 반감기가 5시간 이내인 물질 : 작업중 혹은 작업이 끝나기 2시간 예) 이황화탄소, 일산화탄소, 아세톤 등 - 반감기가 5시간을 넘어 주중에 축적될 수 있는 물질 : 주초나 주말에 채취 예) 트리클로로 에틸렌 등 - 반감기가 대단히 길어서 인체에 축적되는 물질 : 채취시간이 중요하지 않음 예) 각종 중금속(납, 카드뮴)

13. The relationship between the half-time of a substance in blood or urine and sampling strategy WHO. Biological monitoring of chemical exposure in the workplace. Geneva, 1996. p8

14. 다. 시료채취용기, 채취량, 채취방법 ○ 시료채취용기는 오염되지 않은 것을 사용 ○시료채취용기로 분석대상물질을 용출시키거나 흡착시키는 용기 사용금지 ex) 초자기구, 고무, 수지에는 납이 들어있을 가능성 있음 ○ 시료채취량은 측정 및 분석감도를 고려하여, 분석에 필요한 양을 충분히 확보 만일을 위해 재분석이 가능한 양을 확보하여 보관하는 것이 좋다. ○작업 후 소변을 채취하는데 어려움이 따르는 것을 예방하기 위해 시료채취 2시간 전에는 배뇨를 하지 않도록 사전에 교육 ○시료를 채취할 때는 작업환경이나 의복에 있는 물질에 오염되는 것 방지 ○ 혈액이나 호기 중 유기용제는 작업 후 급격히 감소하므로 작업 직후에 채취 ○혈액이나 소변 중 휘발성 유기용제를 분석하려고 하는 경우에는 시료채취용기에 90% 이상 채워 채취하여 마개를 단단히 막은 후 냉장 보관하여 유기용제가 휘발되지 않도록 한다.

15. 혈액 : 측정하고자하는 거의 모든 물질이 존재함 - 정맥혈을 기준 - 적절한 항응고제의 선택 - rubber stopper에 의한 유기용제 등의 흡착고려 - 중금속 측정시 채취용기에 의한 오염방지 대책필요 - 분석용 시료의 균질성 확보 소변 : 수용성(극성)화학물질, 금속, 대사산물 측정에 적당하고 대개 혈중의 농도 혹은 신장에서의 농도를 반영한다. - sampling time - 시료오염 방지 - 시료의 농축도 고려

16. 라. 시료운반과 보관방법 ○혈장으로 분석하는 것은 혈액 채취 후 빠른 시간 내에 원심 분리하여 혈장 확보 ○즉시 분석하지 못하면 분석 대상물질의 성질에 따라 냉장 또는 냉동 보관 ○전혈중 중금속을 분석하는 경우 즉시 분석하지 못하는 경우 냉동 보관 ○소변은 채취하여 아이스박스 등을 이용하여 냉장 상태로 운송 후 분석 ○소변 중 휘발성 물질의 분석은 2일 이내로 하도록 하여야 하며, 비휘발성 대사물질의 경우 즉시 분석할 수 없고 5일 이내에 분석할 수 있으면 냉장보관할 수 있으나, 그 이상 지연되는 경우에는 냉동보관

17. 마. 시료 분석 및 정도관리 ○시료의 전처리와 분석은 타당성이 검증된 방법을 사용하여 처리 및 분석 ○분석자는 분석기기의 취급방법을 숙지하고 유지관리를 철저히 하여, 항상 최상의 조건에서 분석할 수 있도록 하여야 한다. ○각 실험실에서는 반드시 내부정도관리 및 외부정도관리 실시

18. 적절한 생체시료의 가용성(시료의 선택) 가. 혈액을 이용한 모니터링 ○ 장점 - 구성성분의 개인간 차이가 적다. - 시료채취시 오염되는 경우가 적다. ○ 단점 - 시료채취시 근로자에 부담을 준다. - 보관,처치에 주의를 요한다. - 약물동력학적 변이 요인들에 영향을 받는다. ○ 시료채취, 보관, 분석시 고려사항 - 생물학적 기준치는 정맥혈을 기준 - 적절한 항응고제 선정 - 고무마개에 의한 흡착 고려 - 중금속 측정시는 용기에 의한 오염 방지 대책 필요 - 분석용 시료채취시 균질성 확보 - 혈액중 지표물질의 존재 상태에 따른 분석법 검토 ․ 자유형, 결합형(페놀, 삼염화물, 아미노 페놀 등), 단백질 결합(극성 물질) - 휘발성 물질 측정시 시료 손실을 방지하기 위하여 최대 용량으로 채취

19. 나. 소변을 이용한 모니터링 ○ 장점 - 비파괴적 시료채취 - 많은 양의 시료 확보가능 ○ 단점 - 소변 배설의 변이요인 - 보정필요 - 시료채취중 오염 가능성 ○ 소변 배설과 관련된 참고치(평균, 범위) - 소변량(L/day) : 1.2*(0.6-2.5) - 고형물 양(g/day) : 50(30-70) - 비중 : 1.020(1.003-1.030) - 크레아티닌(g/day) : 1.0-1.6 g/L (0.3-3.4) - 산도 : 6.0(4.6-8.0) ○ 시료채취, 보관, 분석시 고려사항 - 시료채취 시간에 신경을 써야 한다. - 시료 오염에 주의 - 시료의 농축도

20. ○ 소변의 농축도 보정 • Urinary specific gravity 보정농도 = 0.02 x 측정농도/(S.G.-1) • Urinary creatinine 보정농도 = 측정농도/소변중크레아티닌농도 * 크레아티닌(creatinine) : creatinine은 근육중의 free creatine이나 creatine phosphate와 샅은 creatine의 탈수물이며 내인성 단백대사의 종산물로서 혈액 중에서 가장 안정적이고 신장으로 배설되는 질소성분 중 배설이 잘되는 물질 • 배설량(w/hr) 보정시 보정농도 = 측정 소변배설량(L/hr) x 측정농도(g/L) /0.050 * 측정 3시간 전에 배뇨시킨 후 시간을 기록, 작업종료 직후 소변을 받은 후 배설량 확인 및 시간 기록

21. 크로마토그래피- HPLC분석법 -

23. Chromatography 란? • 서로 다른 종류의 분자가 이동상(mobile phase)에 실려 컬럼(고정상,stationary phase)을 통과하면서 분배, 흡착, 이온교환, 분자크기배제 및 친화력 등의 기전에 의해 성분별로 컬럼에 머무르는 시간의 차이가 발생되는 현상을 이용한 것

24. 크로마토그래피의 개요 및 원리 • 어원 • Chromatography =Chroma (색) + Graphein (기록) • 최초의 크로마토그래피 • 1903년 러시아의 식물학자 Mikhail Tswett : 최초로 유리관에 흡착제(탄산칼슘)를 충전시켜 석유 에스테르를 사용하여 식물 잎의 엽록소(클로로필, 크산토필 등)를 분리하는 실험을 고안하여 이 방법을 Chromatography라 명명 함 • 개요 • - 크로마토그래피는 화합물들의 혼합상태를 구성 성분들로 • 분리하는 방법 • - 각각의 구성 성분들로 분리함으로써, 다양한 시료 성분들을 • 정성적으로 그리고 정량적으로 쉽게 측정할 수 있음

25. Adsorption Partition Ion-exchange Affinity Molecular exclusion • 분리원리에 따른 Chromatography 분류

26. 분리원리에 따른 크로마토그래피 • 흡착 크로마토그래피(adsorption) 고체 정지상과 액체 혹은 기체 이동상 • 분배 크로마토그래피(partition) 액체 정지상과 액체 혹은 기체 이동상 • 이온교환 크로마토그래피(Ion-exchange) 이온수지 정지상과 액체 이동상 • 분자배제 크로마토그래피(molecular exclusion) • 친화 크로마토그래피(affinity)

27. Chromatography의 종류 ------------------------------------------------------------- 이동상(Mobile phase) 고정상(Stationary phase) 기전(Mechanism) ------------------------------------------------------------- HPLC liquid solid LSC adsorption exclusion ion exchange liquid LLC partition ------------------------------------------------------------- GC gas solid GSC adsorption liquid GLC partition -------------------------------------------------------------

28. 구분 Gas Chromatography(GC) Liquid Chromatography(LC) 이동상 기체 액체 특성 시료의 휘발성 시료의 용해성 분자량 분자량의 제한(<500) 분자량의 상한선이 없다. 분리법 시료+충진제+carrier gas 시료+충진제+용매 분리 시료와 고정상의 화학적 친화력 시료의 b.p 차에 의하여 시료와 고정상 및 이동상과의 상호 화학적 친화력에 의한 분리 시료 휘발성(volatile) 비휘발성(non-volatile) 시 료 회수율 40∼70% TCD, 혹은 cooling system 필요 100% 분석시간 짧다. 길다. 특징 열에 대한 분자의 안정성 고려 열적 안정성 무관 기체크로마토그래피와액체 크로마토그래피의 비교

29. Chromatography구성도 Mobile phase Stationary phase Detector GC Gas (N2, He, H2) FID, ECD, NPD MSD, TCD, etc Column (Capillary,Packed) HPLC Liquid (H2O, MeOH,ACN) Column UV/VIS, FLD, ECD, MS, etc

30. HPLC

31. 고속액체크로마토그래프(HPLC)

32. HPLC-Solvent Delivery System -(PUMP)

33. Pump • 용매 저장용기에서 용매를 끌어서 시료주입기로 밀어주는 역할을 담당하며, 일정한 압력으로 컬럼에 보내는 고압펌프 ① 펌프 내부는 용매와의 화학적 상호반응이 없어야 한다. ② 최소한 5000psi의 고압이 가능해야 한다. ③ 유속은 조절이 가능해야 하며 일정한 유속과 압력을 유지해야한다. ④ 펌프서 나오는 용매의 공급은 펄스가 없어야 한다. ⑤ 용매의 유입의 재현성은 1% 이내이어야 한다. ⑥ 기울기 용리가 가능해야 한다. ⑦ 다양한 용매의 사용이 가능해야 한다.

34. Isocratic : 분석시간 동안 이동상 조성의 변화가 없는 형식 • Gradient : 분석시간 동안 이동상의 조성이 시간의 흐름에 따라 변함

35. HPLC- Injector -

36. 시료주입기 (Injector) • 이동상에 시료를 Loading 하여 Column으로 보내는 역할 • Injector 의 종류 • Rheodyne Injector (Valve Injector) • Automatic Injector

37. 시료주입기작동시 유의사항 • 잘 세척된 Syringe 사용 • 시료 주입시 기포는 완전히 제거 • Syringe 세척은 시료가 잘 녹는 용매를 사용 • 강한 세척 요구 시, 사용용매 Acetone  Dichloromethane 순으로 세척 • Auto injector needle wash 용 용매 사용 시 주의 • 시료확산을 방지하기 위해 injector와 column, column과 detector사이 연결을 짧게 연결(0.009inch) • 잘못된 Tubing 연결 시 dead volume 생김.

38. Rheodyne Injector • 주입량이 loop에 의해 정해짐 • Loop 를 교체하여 주입량 변화시킴 • Sample loop 세척이 요구

39. Automatic Injector • Free injection하여 생산성을 향상 • 96 Step의 조건입력 가능 • 4 ml vial , 1 ml vial 를 무인 가동할 수 있으므로 분석 시간 단축 • 온도 조절을 통해 시료의 변성 가능성을 최소화 • 시료의 주입량의 오차가 거의 없으므로 재현성 우수 • Auto priming 및 Auto needle washing이 가능함

40. HPLC- Detector -

41. 검출기의 종류 • Optical Detector UV/Vis detector : aromatic ring, double(triple) bond, UV 유도체 Fluorescence detector : PAH(pyrolring), amino acid등 Refractive detector : General • Electrochemical detector Conductivity detector : 이온 화합물질 Electrochemical detector : Catecholamine, estrogen 등

42. UV/VIS Detector • 광원에서 특정 파장의 빛이 광이나 장치를 거쳐 cell내의 시료에 투사되면 일부는 흡수되고, 일부는 시료를 통과하게 되는데, 특정한 시료는 특정파장의 빛에 대한 흡광도가 높아서 시료를 투과하는 빛의 강도는 상대적으로 작아지게 된다. • 이 때 흡수되는 빛의 양(A)은, • 용액내의 흡광 시료의 농도 (C)에 비례하고 • 빛의 파장과, • 시료의 특징적인 흡광spectrum, • 빛이 시료를 통과하는 거리 (path length, b) 와 관계가 있다. A = ebc(Lambert-Beer Law)

43. 1) Fixed type • 광원 (Lamp)에 따라 정해진 몇 개의 파장만을 사용할 수 있다. • Wavelength : 214,229, 254,265,280,313,340,405,436,546nm 2) Variable type • 190-600 nm 사이의 모든 파장 중에서 원하는 파장을 지정하여 사용

44. Solvent UV Cutoff Solvent UV Cutoff Water 180 n-Heptane 197 Methanol 210 Cyclohexane 200 n-Propanol 205 Carbon tetrachloride 265 Acetonitrile 190 Chloroform 245 THF 230 Benzene 280 Acetone 330 Toluene 285 Methyl acetate 260 Methylene chloride 232 Ethyl Acetate 260 Tetrachloroethylene 280 Nitromethane 380 1,2-Dichloroethane 225 • UV Cutoff of Common Solvent

45. Fluorescence Detector • 원리 • Excitation filter를 통과한 빛은 sample cell에 존재하고 있는 시료 분자를 excited state로 만들어 준다. • 이 시료분자가 Ground state로 떨어지면서 흡수한 파장보다 긴 파장의 빛을 방출하게 된다. • 시료는 분자구조가 형광성을 띠거나 형광 유도체를 만들었을 때 이용 • 발광하는 빛의 양은 시료의 농도에 비례하며 발광량에따른 전기적 신호의 크기가 정량의 척도(UV/VIS 보다 100배 감도가 높음) • 형광 물질 • Benzene 고리 치환물 중 작용기가-OH, -OCH3, -H2, -NH(CH3),-N(CH3)2, -F, -CO등인 화합물 • 유도체화된 아미노산, carbamate, PAH, Vitamine E, Riboflabin

46. Electrochemical Detector • 원리 • 검출기의 Working electrode와 시료 사이의 전기화학 반응 : 산화/환원 반응으로 인한 current의 차를 측정 • 작은 DC전압이 working electrode에 걸리면서 working electrode에 접촉된 시료성분이 산화 환원을 일으킨다. 산화 환원으로부터 발생된 electrolytical current가 측정되고, 이것은 analog signal로 출력하게 된다. • 비교적 낮은 전위에서 수용액 내에서 산화반응이 쉽게 일어나는 이온의 검출에 사용된다. • 환원반응은 대체로 적당하지 않은데, 이는 용존 산소를 제거해야 하는 번거로움이 있기 때문이다. • 이용범위 • Catecholamine, 뇌조직 내 신경전달물질의 산화, phenolic compound와 쉽게 산화되는 무기 착화합물 등

47. ConductivityDetector R = 두 전극간의 전기적 저항 A = 전극의 면적 K = 용액의 전도도 1 R = KA • 원 리 • 금속 도체는 다음과 같이 ohm법칙에 따른다. • 검출실내의 이온 농도가 증가하면 K값이 커지고 R값이 작아져서 전극의면저과 거리가 일정할 때 두 전극간의 전기 전도도가커지게 된다

48. Conductivity Detector Mobile phase Mobile phase plus sample • 구조

49. Column

50. 컬럼(column) 컬럼은충진용기와충진제로 구성 ․ 충진용기: Stainless steel, Resin, Glass 등 ․ 충진제: 순상, 역상, 이온교환, 겔 침투(여과)충진제 등