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ENSAIOS IMUNOQUÍMICOS Técnicas Imunológicas Ensaios Hormonais

ENSAIOS IMUNOQUÍMICOS Técnicas Imunológicas Ensaios Hormonais. BIOMEDICINA FIEL. DAISY DE SOUZA ARAÚJO . PATOLOGISTA-CLÍNICO. Reações imunoquímicas. Reação - ANTÍGENO + ANTICORPO – princípio básico: detecção deste complexo Reação química especial

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Presentation Transcript

    1. ENSAIOS IMUNOQUMICOS Tcnicas Imunolgicas Ensaios Hormonais BIOMEDICINA FIEL

    2. Reaes imunoqumicas Reao - ANTGENO + ANTICORPO princpio bsico: deteco deste complexo Reao qumica especial Reconhecimento do antgeno (depende do tipo de antgeno a ser pesquisado)) Superfcie da clula Disperso em soluo Parmetros que dependem do Anticorpo Utilizado Sensibilidade (anticorpos policlonais ou monoclonais, classe de anticorpo) Especificidade anticorpos policlonais ou monoclonais, classe de anticorpo) Afinidade Avidez Diversidade

    3. Classificao dos Imunoensaios

    4. Reaes de Precipitao QUANTIFICAO dos complexos formados pela reao Antgeno+anticorpo que se precipitam no meio. Reao Antgeno x Anticorpo REVERSVEL O precipitado se dissolve quando h excesso de um dos componentes: FENMENO PR0-ZONA Desnecessria separao do complexo antgeno+anticorpo (fase ligada) das substncias livres no meio COMPLEXO ANTGENO-ANTICORPO pode ser quantificado: visualmente a olho nu visualmente usando um microscpio por medida da turbidez (turbidimetria) quantificado por nefelometria

    5. Reaes de Precipitao Fatores interferentes: Concentraes do antgeno e do anticorpo presentes no sistema (amostra+reagente) Outros fatores fsico-qumicos (temperatura, pH) Precipitao mxima: concentraes equivalentes de Antigeno (Ag) e Anticorpo (Ac) Sensibilidade: 10 microgramas/mL

    8. Reaes de Precipitao Direta Clssica triagem inicial p/ SFILIS OU LUES VDRL Venereal Desease Research Laboratory RPR Reagina Plasmtica Rpida RPS - Reagina Para Sfilis medido nestas reaes: presena de anticorpos para o material lipoproteico das clulas danificadas pela doena. presena de anticorpos para a cardiolipina dos Treponemas Mtodos no treponmicos e INESPECFICOS Sensibilidade: 78% na fase primria (74 a 87%) 100% na fase secundria 95% na fase latente (88 a 100%) 71% na fase tardia (37 a 94%)

    9. Reaes de Precipitao DERIVADAS MANUAIS Imunodifuso Imuno-eletroforese (contra imuno eletroforese) Imunofixao Eletroimunodifuso UTILIZADAS EM LABORATRIOS DE PESQUISA AUTOMATIZADAS NEFELOMETRIA E TURBIDIMETRIA UTILIZADAS EM GRANDES LABORATRIOS

    10. Nefelometria e Turbidimetria Possibilidade de Automao total Nefelmetros Equipamentos de bioqumica (turbidimetria) Dosagem de protenas em sangue e outros fluidos (exemplo LCR) Alfa 1 glicoprotena cida (mucoprotena) Fator Reumatide Microalbumina Protena C Reativa Apoliproprotena inmeras outras substncias (imunoglobulinas, transferrina etc)

    13. Reaes de Aglutinao Formao de agregados grandes de partculas com mltiplos determinantes antignicos interligados por pontes moleculares de anticorpos; Ligao: stios antignicos iguais em diferentes partculas Detectam tanto a presena de IgM quanto de IgG Visualizao: depende do tamanho dos agregados formados Pode ser realizadas em placas, tubos ou lminas:

    14. Reaes de Aglutinao Fatores interferentes: Classe do Anticorpo envolvido; Eletrlitos; Macromolculas Hidroflicas; Enzimas; pH (6 a 8); Tempo; Temperatura

    16. Falso Negativas Quantidade pequena de anticorpos: a partcula ficar com o anticorpo preso a sua superfcie (sensibilizada), no formando pontes e no aglutinando; Quantidade muito grande de anticorpos (fenmeno Pr-zona)

    17. TIPOS DE PARTICULAS UTILIZADAS Determinantes antignicos Naturais: Eritrcitos humanos determinao grupo sangneo ABO Bactrias SLIDEX meningites Protozorios Partculas inertes revestidas Ltex (mais comum) teste de gravidez Gelatina Betonita, polipeptdeos Clulas antigenicamente no relacionadas Clulas revestidas com antgenos solveis: ou com antgenos solveis adsorvidos ou fixados Hemcias e bactrias

    18. Aglutinao: Tcnicas mais Utilizadas Aglutinao direta : ex teste de gravidez Aglutinao passiva Hemaglutinao direta: ABO RH Hemaglutinao indireta: Toxoplasmose Hemaglutinao Passiva Inibio de Hemaglutinao Inibio de Hemaglutinao passiva

    21. Imunofluorescncia Manual 1 Baseia-se na capacidade das molculas de anticorpo se ligarem covalentemente a fluocromos, mantendo a especificidade contra o antgeno. Reagentes Utilizados: Anticorpos Marcados (Fluocromos Isotiocianato de Fluorescena* ) Glicerina Alcalina Corantes (Azul de Evans)

    22. Imunofluorescncia Manual 2 - DIRETA A reao Ag-Ac detectada pela emisso de fluorescncia Pesquisa de antgeno amostra (Ag??) + Ac especfico conjugado a substncia fluorescente (conjugado)* microscpio de fluorescncia

    24. Imunofluorescncia Manual 3 IFI - INDIRETA A- pesquisa de antgeno amostra (Ag??) + Ac especfico Ag-Ac * Ag-Ac + conjugado anti-imunoglobulina * microscpio de fluorescncia * lavagens B- pesquisa de anticorpos Ag (lmina) + soro do paciente (Ac??) Ag-Ac * Ag-Ac + conjugado anti-imunoglobulina * microscpio de fluorescncia determinao do ttulo e classe do Ac

    27. IMUNO-ENSAIOS QUANTITATIVOS classificao tipo de reao (cintica) COMPETITIVOS H competio entre a substncia presente na amostra (ou o padro) e outro marcado com alguma substncia geradora de sinal, por uma quantidade limitada de anticorpos especficos variante: Radioimunoensaio (RIA). NO COMPETITIVOS: So utilizados dois anticorpos, um ligado fase slida e outro marcado com alguma substncia geradora de sinal, que se ligam a SUBSTNCIA em estudo - Mais preciso e reprodutvel, e possui nveis de sensibilidadeanaltica superiores. Desvantagem, precisam ter dois eptodos. Variante: Imunomtrico

    29. Competitivo ou no Competitivo: Quanto maior a concentrao do analito menor a contagem do sinal Amostras positivas tem leitura abaixo do valor limiar ou cut-off No Competitivo Quanto maior a concentrao do analito maior a contagem do sinal Amostras positivas tem leitura acima do valor limiar ou cut-off

    30. IMUNOENSAIOS QUANTITATIVOS: COMPETITIVOS anticorpo primrio na fase slida (pag 963) e antgeno marcado anticorpo secundrio na fase slida (pag 964) e antgeno marcado NO COMPETITIVOS SEQUENCIAL SANDUCHE

    31. IMUNOENSAIOS QUANTITATIVOS: CLASSIFICAO TIPOS / SIGLAS Marcador radioativo: Radioimunoensaio (RIE) Imunorradiomtrico (IRMA) Marcador enzimtico Enzimaimunoensaio (EIA) ELISA - Ensaio imunoenzimtico MEIA - Ensaio imunoenzimtico de micropartculas Marcador FLUORESCENTE Imunofluoromtrico (IFMA) FPIA Fluorescence polarization immunoassay ELFA - Enzyme Linked Fluorescent Assay Marcador QUIMIOLUMINESCENTE Quimioluminescncia convencional EQL, Eletroquimioluminescncia (ECLIA) Ensaio imunolgico quimioluminescente magntico CMIA

    33. IMUNOENSAIOS QUANTITATIVOS: Fatores Interferentes: Reao cruzada: Ocorrem devido a, baixa especificidade dos anticorpos utilizados e o uso de anticorpos policlonais. Presena de Anticorpos Heterfilos: Resultados falso positivos ou altos em pacientes transplantados ou submetidos a tratamento com antoicorpos monoclonais

    35. IMUNOENSAIOS QUANTITATIVOS Fatores interferentes II Contagem de fundo elevada (Background) Leituras mais elevadas do que as reais por ligao inespecfica de constituintes do soro ao suporte slido, lavagens inadequadas ou conjugados de pobre afinidade. Efeito HooK Resultados menores do que o esperado na quantificao de substncias que na realidade encontram- se elevadas, bloqueando a ligao.

    37. Ensaios com marcadores RADIOATIVOS RIA, RIE, IRMA pouco usado na rotina: exige profissional com credenciamento na CNEN (curso de seis meses em So Paulo) um dos componentes do sistema marcado com istopo radioativo ensaios competitivos : o reagente marcado = substncia que se quer dosar (antgeno) (RIA/RIE) ensaios no competitivos: o reagente marcado um segundo anticorpo (IRMA) O radioistopo mais utilizado o I125 (57,5 dias)

    38. Ensaios com marcadores ENZIMTICOS EIA, ELISA, MEIA, ELFA EIA Enzyme Imunoassay - Ensaio imunoenzimtico ELISA - Enzyme- Linked ImmunoSorbent Assay MEIA Microparticule Enzyme Immuno Assay ou Ensaio imunoenzimtico de micropartculas ELFA Enzyme- Linked Fluorescent Assay: Ensaio imuno-enzimtico fluorescente

    40. ETAPAS ELISA, EIA sensibilizao (ou cobertura) da fase slida: adio de Ag ou do Ac bloqueio (protena inerte: soro fetal bovino, leite desnatado) * adio da amostra (em diluente) * adio do conjugado: anticorpo purificado marcado com enzima (ex: peroxidase) * adio do substrato cromognico: peroxidase: H2O2 (substrato) + OPD (ortofenilenodiamina) interrupo da reao: SDS ou cido forte leitura: leitor de ELISA * lavagens

    43. EIA ELISA Vantagens e Desvantagens Sensibilidade, especificidade e simplicidade da tcnica; Cuidados com interferentes, reaes cruzadas Versatilidade, rapidez, baixo custo e objetividade da leitura; Erros operacionais, variveis analticas Adaptao a diferentes graus de automao Instabilidade dos reagentes Influncia em manipulaes e do equipamento

    46. Ensaios com marcadores FLUORESCENTES MEIA, ELFA, FPIA MEIA Microparticule Enzyme Immuno Assay ou Ensaio imunoenzimtico de micropartculas (deteco fluorescente Axsym) (ABBOTT) ELFA Enzyme- Linked Fluorescent Assay: Ensaio imuno-enzimtico fluorescente IFMA: Immuno FluoroMetric Assay ou ensaio Imunofluoromtrico FPIA: Fluorescence Polarization ImmunoAssay

    47. Ensaios com marcadores FLUORESCENTES Utilizam enzimas com substratos Fluorescentes Utilizam aparelhos denominados de Fluormetros; As tcnicas diferem quanto ao suporte slido As tcnicas diferem tambm forma de ampliar o sinal; Exemplos: MEIA, ELFA, FEIA; FPIA Possui sensibilidade e especificidades elevadas; Bom mtodo para dosagens hormonais

    49. QUIMIOLUMINESCNCIA I Reao entre o Ag/Ac, marcada com fosfatase alcalina. Hidrolisa o substrato Quimioluminescente gerando um produto instvel o qual aps estabilizao gera emisso de ftons de luz medida por FM, que tem a funo de transformar a luz emitida pelos ftons em impulsos eltricos(CPS). So reaes de oxidao ?luz no espectro visvel;

    50. QUIMIOLUMINESCNCIA II A sensibilidade de um mtodo enzimtico aument cerca de dez vezes mais substituindo um substrato cromognico por um luminescente; a emisso de luz produzida em algumas reaes qumicas envolvendo molculas que emitem luz, quando passam do estado de excitao para o basal eletrnico; So altamente sensveis; Mtodo de escolha para quantificao de substncias, como hormnios e marcadores tumorais.

    56. QUIMIOLUMINESCNCIA Pra que serve??? Qual vantagem? UTILIDADES: Dosagem de marcadores tumorais (PSA, CA-125, CA 15-3, CA-19-9, CEA, AFP) HORMNIOS DOENAS INFECCIOSAS: HIV, Hepatites, VITAMINAS DOSAGEM DE IGE TOTAL HOMOCISTENA VANTAGENS: Sensibilidade 10 x maior na troca de substrato cromognico por um luminescente

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