Protein-protein Interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用

1. Protein-protein Interaction蛋白质-蛋白质相互作用 03/27/2009

2. Protein-Protein Interactions- A Common Theme in Cell Biology 蛋白质-蛋白质相互作用 细胞生物学领域的普遍主题

3. Protein-Protein Interactions Cell assembly and function/细胞组装与功能 Stable, DNA mutation Headquarter * DNA * RNA * Protein Stable/Versatile, rRNA, tRNA, mRNA Messenger Versatile, Protein modification Protein-Protein interaction Protein-Other component interaction Executor

4. Protein-Protein Interactions Cell assembly and function Single protein Protein complex Protein complex interaction Protein complex network Cell, Versatile, Dynamic, Accurate regulation……

5. Interaction Domain - Structural basis for protein interaction 相互作用区域是蛋白质相互作用的结构基础 * 信号蛋白，调节蛋白以及大多数其他的蛋白质都具 有包括相互作用区域在内的好几个结构域； * 有些多肽仅由相互作用区域组成，从而充当蛋白质复合物的核心。

6. Interaction Domain - Structural basis for protein interaction 相互作用区域是蛋白质相互作用的结构基础 *SH2 domain: phosphotyrosine-containing peptides recognition domain。 SH2 分布最为广泛，识别特定的含有磷酸化Tyr的多肽模块。 Src SH2 domain: Grb2 SH2 domain: SH3 SH3 SH3 SH2 Y kinase SH2 pYEEI pYVNV

7. Interaction domain and Protein interaction Signaling transduction pathway

8. Physiological functions of protein interactionsLocalization 蛋白质的亚细胞定位 *蛋白质的亚细胞定位与其 功能密切相关； * 涉及： 蛋白质-蛋白质相互作用； 蛋白质与磷脂的相互作用； * 蛋白质的组织特异性与 亚细胞定位的研究是蛋白 质功能研究的起始步骤

9. Physiological functions of protein interactionsLocalization and Trafficking • Protein-protein interaction can be used to build complex biological systems. 蛋白质-蛋白质相互作用是功能复合物形成的基础。 （如线粒体内膜呼吸链）

10. Physiological functions of protein interactionsLocalization and Trafficking • Aberrant interactions can contribute to pathogenesis; 错误的相互作用可能导致病理形象的出现。 如 Alzheimer’s disease, beta-淀粉样结构的堆积；

11. Inducible protein interaction & posttranslational modifications可诱导的蛋白相互作用与翻译后修饰 • Dynamic behavior of cells in response to changing conditions is highly dependent on posttranslational modifications; 细胞面对不断改变的环境表现出来的动态行为有赖于蛋白质的翻译后修饰以及它带来的蛋白质相互作用的变化。

12. Techniques and computation Biophysical Techniques Mass Spectrometry Surface Plasmon Resonance Atomic Force Microscopy NMR X-ray Crystallography High Throughput Techniques Library Screening Degenerate Peptide Libraries Spot Blots Co-IPs GST-pulldowns Yeast 2-Hybrid Phage Display Standard Techniques Co-IPs GST-pull downs Yeast 2-Hybrid Phage Display In vivo Imaging FRET BRET Elucidation of Protein-Protein Interactions Protein Interaction Networks

13. Techniques：Principle, Process, Advantage and DisadvantageGST-Pull down Principle: Affinity purification Affinity between Interaction motif /polypeptide and its interaction proteins; Advantage: Direct interaction / In vitro Process: Affinity purification from tissue or cell lysate Interaction motif Affinity column Making Immobilized on Glutathione beads GST

14. Techniques：免疫沉淀

15. 质量作用定律决定IP的成功度

16. Techniques： 免疫沉淀（非变性） • 免疫沉淀的灵敏度取决于Protein A (or G) 与 IgG的Kd、IgG与抗原的Kd值。所以增加抗原或抗体的浓度、使用与抗体直接共价偶联的珠子进行免疫沉淀可以提高灵敏度； * Kd Kd IgG Protein A Bead Antigen Kd IgG * Antigen

17. Co-Immunoprecipitation /共免疫沉淀 Principle: Affinity purification/ 亲和纯化 Advantage: In vivo (Physiological status) / 代表生理状态下的相互作用 Cell Lysis and Immunoprecipitation of protein X Z X Z Y X Y 细胞裂解与蛋白质X的免疫沉淀 Cell

18. Techniques：免疫沉淀（非变性） • 生理活性的保持： • a. 全程低温操作； • b. 裂解液中加入蛋白酶抑制剂； • 2. 免疫沉淀的灵敏度取决于Protein A(or G) 与 IgG的Kd、IgG与抗原的Kd值。 • 所以增加抗原或抗体的浓度、使用与抗体直接共价偶联的珠子进行免疫沉 • 淀可以提高灵敏度； * Kd Kd IgG Protein A Bead X Kd IgG * X

19. Techniques：免疫沉淀（非变性） 免疫沉淀的产物如用于SDS-PAGE及及免疫印迹进一步分析时， * 需要去除盐的干扰，PBS 或其它洗涤缓冲液应可能去除； 大量IgG掺入也影响电泳的效果，如脱尾和扩散。 检测信号十分微弱时，这种条带的扩散可能导致根本无法获得 信息；

20. Techniques：免疫沉淀（非变性） 免疫沉淀的产物如用于SDS-PAGE及及免疫印迹进一步分析时， 大量的IgG掺入样品后导致免疫印迹时出现非特异性条带； 对免疫共沉淀的结果分析影响尤其大； • 用目的蛋白的抗体进行 • 免疫沉淀，再用免疫印 • 迹法进行检测； 目的蛋白 IgG

21. PDGF GFP WT YF Mut(6) GFP WT YF Mut(6) - + - + - + - + - + - + 198 115 MTSS1-GFP MTSS1-GFP 93 49.8 35.8 GFP 29.2 IP: GFP IB: 4G10 (pTyr) Reblot: GFP

22. Techniques：免疫共沉淀（非变性） 操作同非变性免疫沉淀，只是检测的是相互作用蛋白； 其效率还涉及复合物中蛋白质X，Y，Z的Kd值。 Protein A IgG Protein X* Protein Y Protein Z Z Kd Y X Kd IgG Kd Protein A Bead Kd

23. Techniques：免疫共沉淀（非变性） 1. 免疫复合物中蛋白质X， Y，Z的Kd值越小，即越稳定， 有利于免疫共沉淀的进行; 2. 免疫沉淀中提高灵敏度的方法同样适用于免疫共沉淀； Protein A IgG Protein X* Protein Y Protein Z Z Kd Y X Kd Kd Kd

24. Techniques： 免疫共沉淀（非变性） 细胞裂解液的几点考虑： 1. 复合物的稳定，提高灵敏度，但会降低特异性； 2. 针对特定的复合物，细胞裂解液中可能加入磷酸酯酶 抑制剂或者ATP及一些金属离子以维持复合物的稳定；

25. Techniques： 免疫共沉淀 免疫共沉淀中的非特异性： X Y 细胞裂解 x A B Y B 蛋白质X的抗体 进行免疫沉淀 X Y X A

26. Techniques：免疫共沉淀：基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑（类型 I） 细胞裂解 A x A X Y B 蛋白质X的抗体 进行免疫沉淀 原因：抗体的非特异性

27. Techniques：免疫共沉淀：基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑（类型I）Techniques：免疫共沉淀：基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑（类型I） 1.抗体的质量：抗体的特异性； 2.尽可能的设置多种阴性对照； 一般采用兔子免疫前的血清(pre-immune serum) 同时进行免疫沉淀及后续分析; 3.使用目标蛋白的多种抗体进行免疫沉淀并比较； 4.采用不表达目标蛋白的细胞裂解物同时进行免疫 沉淀并比较； 5.增强细胞裂解液的严谨性，降低非特异性； 6.检测两种蛋白质的相互作用时，同时用两个蛋白质的抗体进行实验；

28. Techniques：免疫共沉淀：基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑（类型 II） X Y 细胞裂解 x A B Y B 蛋白质X的抗体 进行免疫沉淀 X X Y X • 抗原复合物与其它蛋白质的非特异性相互作用； • 抗原复合物解离

29. Techniques：免疫共沉淀：基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑（类型 II） * 当 X-Y 的复合物不很稳定或解离常数大时，可以考虑使用细胞 可渗透的交联剂(Cross-linker) ° A 活性基团 NH2 Y 活性基团 NH2 X 细胞裂解 x A Y B 蛋白质X的抗体 进行免疫沉淀

30. Techniques：免疫共沉淀：基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑（类型 II） * 当 X-Y 的复合物是瞬间形成的或解离常数大时，可以考虑 使用细胞可渗透的交联剂(Cross-linker) ° A 活性基团 NH2 活性基团 NH2 Y X

31. Techniques：免疫共沉淀：基于免疫共沉淀中非特异性的实验设计考虑（类型 II） 细胞裂解 x X A Y Y B 蛋白质X的抗体 进行免疫沉淀

32. 研究方案:Affinity purification & MS 目标蛋白带上Tag 带Tag的目标蛋白与固相基质偶联 目标蛋白相互作用蛋白的亲和纯化 目标蛋白复合物的SDS-PAGE分离 蛋白质条带的切割和酶解 质谱与生物信息学分析 文献与其他数据库的功能分析 实验验证与功能的探索

33. MTSS1 过量表达促进PDGF诱导的背部变皱膜形成 GFP F-actin GFP F-actin GFP MTSS1-GFP

34. 研究方案:Co-immunoprecipitation & MS MIM-GFP infected NIH 3T3 cell Serum starvation PDGF stimulation Crosslinker stabilize complex Immunoprecipitation with GFP antibody SDS-PAGE Excise bands and digestion Analyze by MS and bioinformatics

35. MS after affinity purification鉴定结果中通常包含很多非特异的蛋白质信息 • 核糖体蛋白 • 代谢酶类 • 热休克蛋白 • 泛肽酶 • 高丰度的细胞骨架蛋白 • 血清蛋白（如果使用是IP亲和的方式） • 去除这些常见的非特异结合的蛋白质（除非它们与你目标 • 蛋白质功能相关）

36. Transcriptional pattern of of MTSS1 and interacting protein candidates identified by Co-IP & MS *利用其他数据库进行的功能分析 http://mouse.brain-map.org/

37. 质谱鉴定数据的分类（Example） • F-actin affinity purification & MS 鉴定小脑发育相关的F-actin binding protein; • Step: (1) F-actin 亲和纯化； (2) MS 数据搜索和初步分析； (3) 按鉴定到的蛋白质与F-actin结合的属性分类; (4) 按MS鉴定到的蛋白质的生物学功能分类； (5) 生物学功能相同或相近的蛋白质聚类, 分析复合物组成； (6) 根据这些蛋白质在小脑不同发育时期的表达模式聚类； (7) 由此将与小脑发育相关的F-actin 结合蛋白与小脑特定发育 时期的功能相联系。

38. 部分鉴定到的F-actin 结合蛋白的功能归属

39. Transcription level of MTSS1 in cerebellum Proliferation & Cell death * Cell migration & differentiation * Dendrogenesis & axogenesis Synaptogenesis Postnatal development stages of cerebellum

40. 蛋白质功能研究的策略 新蛋白 信息学 试验分析 序列同源比较 功能区 为抗体、siRNA, shRNA等的设计提供预测 试验工具： 抗体， 克隆， siRNA, shRNA 生理学背景： 内源表达和 组织及细胞定位 相互作用区域 功能伙伴的预测 筛选相关蛋白 验证相关蛋白： 1. 细胞内共定位； 2. 去除相互作用区域的影响； 3. 新蛋白与相关蛋白在功能上的一致性； 从找到的新相关 蛋白开始，进行新一 轮的筛选，建立功能 网络

41. 利用信息学分析新蛋白的结构和功能区， 并进行相互作用蛋白的预测 CCD WH2 PRD IMD domain F-actin binding Rac binding Y397 Y398 Cortactin binding G-actin binding Src SH2 binding Yamagishi et al, J Biol Chem, 279, 14929, 2004; Mattila et al, J Biol Chem, 278, 8452,2003; Bompard et al, J Cell Sci, 118, 5393, 2005. Lin et al, Oncogene,24, 2059,2005.

42. 利用亚细胞定位及蛋白质相互作用等信息进行蛋白质功能归属利用亚细胞定位及蛋白质相互作用等信息进行蛋白质功能归属 例 1：从免疫共沉淀中得到的蛋白质中筛选重要功能相关蛋白： 利用免疫共沉淀方法找到的9个p53(胞浆和核定位） 结合蛋白 1. GRP-94 GRP-94 2. Alpha-actinin 1 GRP-78 分子伴侣 *** 3. MCM3 GRP-75 4. GRP-78 5. GRP-75 2 MCM3 DNA复制准许因子** 6. Lamin A/C 7. Ezrin/Cytovillin Alpha-actinin 胞浆 8. CD98 antigen 3 Lamin A/C 核纤层 细胞骨架 ？ 9. Protein kinase C Ezrin/cytovilin 胞浆 4 Protein Kinase C 激酶 ？ 5 CD98 antigen 跨膜糖蛋白 X 1

43. 例3 Sra1与Nap1参与Rac诱导的片状伪足形成 从牛脑中用传统的柱层析分离到的蛋白质复合物，组分 经质谱鉴定，包括Nap1,Sra-1 homologue，PIR121, WAVE1 and Abi等组分。

44. 免疫共沉淀与GST-Pull down验证 Rac活化时复合物的存在

45. Rac活化时Sra-1与Nap1在细胞中的重新定位

46. 1. Sra-1 与Nap1定位于片状伪足顶部 （免疫荧光）

47. RNA 干扰Nap1，Sra1 的表达对Rac功能的影响

48. RNA 干扰Nap1，Sra1 的表达对Rac功能的影响

49. 谢谢！