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Sistema Rh

Sistema Rh. Lilian Castilho, PhD. Simpósio Hemopasso Passo Fundo, 24 a 26/03/2008. Sistema Rh. Sistema complexo 49 antígenos muitos fenótipos no mínimo 200 alelos um fenótipo pode gerar vários genótipos. Principais antígenos D; C/c; E/e

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Presentation Transcript

  1. Sistema Rh Lilian Castilho, PhD Simpósio Hemopasso Passo Fundo, 24 a 26/03/2008

  2. SistemaRh • Sistema complexo • 49 antígenos • muitos fenótipos • no mínimo 200 alelos • um fenótipo pode gerar vários genótipos • Principais antígenos • D; C/c; E/e • 8 haplótipos: Dce(R1),Ce(r’), DcE(R2), cE(r”), Dce(R0), ce(r), DCE(RZ), CE(ry)

  3. SistemaRh:Terminologia • Rh nãoRhesus • Sistema ISBT: 004 • Símbolo ISBT: RH • Fenótipo: D+C+E-c+e+ RH:1,2-3,4,5 Dce/ce ou Dce/dce=R1r • Provável genótipo: DCE/ce, RH*1,2,5/RH*4,5 ou R1r

  4. Questõesfrequentementerealizadas • Por que RhD é tão imunogênico? • Principal causa da DHFR • 40-75% dos D- tornam-se aloimunizados quando expostos a hemácias D+ • Por que o sistema Rh é tão complexo? • - Número elevado de antígenos • D, C/c, E/e (comuns) • ~outros 40 • Variantes • - Diferenças na expressão de D • D positivo ou D negativo? • - D fraco • - D parcial • Por que grupos étnicos Africanos/ Hispânicos desenvolvem anticorpos RhD complicados? • Anti-D em D+, D fraco

  5. RHCE RHD “Rh positivo” ce, Ce, cE, or CE “Rh negativo” Deletado X Europeus- 15-17% X ce C/c E/e RhCE RhD Locus RHDuplicação de 2 Genes antígeno D antígenos CcEe Circulos- representam 32-35 diferentes amino acidos entre RhD e RhCE 1. Esta diferença explica por que RhD é tão imunogênico Maioria dos antígenos de grupos sanguíneos diferem em um (ou poucos) aa

  6. RHCE RHD RHD 5’ 3’ 3’ 5’ ce, Ce, cE, or CE antígeno D antígenos CcEe Durante a replicação cromossômica formação de hair-pins trocas ocorrem - um atua como template para a porção do outro “Conversão gênica” Principal causa para a diversidade RH 3 3’ RHCE 5’ 2. Porque o sistemaRh é tãocomplexo ? • - Localização no cromossomo- genes muito próximos • Orientação – final 3’ face a face um com outro 5’

  7. D Fraco – requer teste indireto da antiglobulina para detecção trocas de único amino ácido (transmembrana) diminuição na QUANTIDADE DE RhD 53 “tipos de D fracos” diferentes Del-expressão muito fraca de D- não detectável por sorologiaadsorve e elui anti-D mais comum em populações Asiáticas D Parcial–epítopos de D alterados tipam como D+ mas desenvolvem anti-D Causas– Troca de único amino ácido na superfície da hemácia - Parte do gene RHD substituído pelo RHCE Diferençasnaexpressão de RhD D-negativo -15-17% Europeus- devido a deleção RHD 3-7% Africanos, 0.5-1% Asiáticos – devido a mutações RHD D-positivo–Maioria tem o gene RHD – MAS HÁ EXCEÇÕES

  8. RhD Fraco V270G Tipo 1 Problemasdevido a D Fraco e Del • Alguns são difíceis de detectar com reagentes sorológicos • Discrepâncias na tipagem: D- com um reagente; D+ com outro • Se unidades de sangue de doador são rotuladas como D- podem estimular anti-D em receptores D- • Exemplos: D Fraco tipo 2 • D Fraco com RHCe em trans • Del- nenhum reagente detecta • 2.Alguns pacientes desenvolvem anti-D • Preconizado- maioria dos pacientes com D fraco não desenvovem anti-D • - altera quantidade da proteína, mas não os epítopos D da supefície • - Não é regra para todos os tipos de D fracos – difícil de pré determinar

  9. Proteína D Fraco • RhD: 10.000 a 25.000 sítios/hemácias • D Fraco: densidade antigênica varia de acordo com o tipo de D fraco: 66 a 5.000 sítios/hemácia 2500 tipo 4 1500 tipo 3 tipo 1 1000 tipo 2 500 Cut off sorológico= 500 ags/hemácias tipo 5 300 D fraco tipo 5: geralmente tipados como RhD-negativo

  10. Proteína Del • RhD: 10.000 a 25.000 sítios/hemácias • Del: densidade antigênica: < 50 sítios/hemácia Cut off sorológico=500 ags/hemácias Del: geralmente tipados como RhD-negativo DEL encontrado nos raros Asiáticos RhD-negativos e são C+ ou E+

  11. - Devido a mutações localizadas na região extracelular DMH- L54P DFW- H166P DHMi- T283I DII- A354D DVII- L110P DHR- R229K DNU-G353R DNB- G355S Problemas com D Parcial Hemácias D Parcial tipam como D+ e não são identificadas até que o paciente desenvolva anti-D possuem epítopos de D alterados NH2 • Devido a proteínas RhD/RhCE híbridas • DIII DIV DV DVI DBT DAR DOL DAU etc.

  12. Proteína D Parcial • RhD: 10.000 a 25.000 sítios/hemácias • Dparcial: densidade antigênica: 500 a 25.000 sítios/hemácia D Cat VI e DAR: podem ser tipados como RhD-negativo

  13. Tipagem RhD: positivo ou negativo? Pacientes * até resolver a discrepância: painel de monoclonais ou genotipagem

  14. Tipagem RhD: positivo ou negativo? Doadores Voce sabe qual é sua unidade RhD-negativo? * genotipagem? ** até resolver a discrepância: genotipagem

  15. D Fracoou D parcial?

  16. Identificação em gel Painel com 12 soros monoclonais (DII, DNU, DIII, DIV, DV, DVI, DVII, DFR, DBT, DHAR, DAR, DCS, DOL, DHK/DAU-4, Weak D 5,7, Weak D type 38) D Fracoou D parcial?

  17. D Fracoou D neg?

  18. D Fraco

  19. D-neg, D fraco ou Del ? – • D conf.

  20. D-neg, D fraco ou Del ? – • D Fraco tipo 38

  21. D-neg, D Fracoou Del ? DEL RHD(M295I)

  22. D Fraco IgG IgM PAP DF1 DVI DF4

  23. Problemas nos testes sorológicos • Testes sorológicos não distinguem D fraco de D parcial com fraca expressão • Testes sorológicos não detectam alguns D fracos, Del e D parcial

  24. Testes sorológicosassociados a testes molecularesauxiliamnaidentificação de variantes do antígeno D D Fraco e D parcial • Imunizam receptores D-negativos • Desenvolvem anti-D

  25. Tubo Gel DVI- Dconf. DVI+ Variações de D IgM Poli 1+/3+ DF1 0/(+) 0/1+ 0/1+ 0/2+ 2+/3+ DF2 0 0 0/2+ 0 4+ 0/2+ DF3 0/1+ 2+ 2+ 4+ 1+/3+ DF4 0/2+ 0/2+ (+)/3+ 1+/4+ 0 DVI 0/1+ 0/1+ 0/2+ 3+ DF1+DF2 0/3+ 02+ (+)/2+ (+)/2+ 4+ DF1+DF4 0/2+ 0/1+ (+)/4+ (+)/4+ 3+ DF1+DF2+DF3 3+ 2+ 2+ Casosenviadosaonossolaboratórioparagenotipagem RHD (2007)

  26. Reagentesanti-D nadetecção de D fraco e D parcial

  27. Genotipagem RHD emdoadores de sangue • Indicações: • Discriminar D neg de DEL e D pos • Discriminar D parcial e D Fraco • Limitações • Custo • Tempo • Imunogenicidade de DEL? • Quemdeveria ser testado? • Doadores de primeiravez • Doadores de repetição (discrepâncias) Esta unidade é RH compatível?

  28. Aplicações clínicasGenotipagem RH • Pacientes com fenótipos D fraco • D fracos mais frequentes devem ser transfundidos com hemácias RhD pos (3 a 6% das unidades RhD-neg são preservadas) • Doadores de sangue • Triagem para DEL e D fraco entre doadores sorológicamente D neg (prevenção da aloimunização)

  29. Recomendaçõesclínicasparapacientes com o fenótipo D fraco Fenótipo D fraco Transfusão D fracotipo 1 RhD-positivo D fraco tipo 2 RhD-positivo D fraco tipo 3 RhD-positivo D fraco tipo 4.0 RhD-positivo D fraco tipo 4.1 RhD-positivo D fracotipo 4.2 RhD-negativo D fracotipo 5 RhD-negativo D fracotipo 11 RhD-negativo D fracotipo 15 RhD-negativo Outrostipos RhD-negativo

  30. Caso Clínico • Paciente Afro brasileira, sexo feminino, 36 anos com sangramento vaginal • Solicitado 2 unidades de sangue • 2 gestações • Tipada como O RhD+ • Anti-D fraco detectado no soro • Sem história de profilaxia Rh (óbvio!)

  31. Caso Clínico Soro testado com painel de 6 monoclonais para detectar D parcial

  32. Caso Clínico • Suspeitas: • D Normal – mas por que o anticorpo? • DIII? • DVII? • Outro D parcial? • Análise Molecular – screening rotina mostou RHD normal • Nenhum gene híbrido presente

  33. Análise do DNA • PCR-SSP para DVII: negativo • PCR-RFLP para DIIIa: positivo • DIIIa! • Paciente possuía o fenótipo D parcial • Anti-D era um aloanticorpo • Paciente ficou muito brava porque seu tipo de sangue estava errado!

  34. Caso Clínico • Paciente Caucasóide, sexo masculino, suspeita de AHAI • PAI positiva, Auto e TDA positivos • Anti-D detectado no soro e eluato • Paciente tipado como D+ • Anti-D: auto ou alo? • Genotipagem!!!!

  35. Caso Clínico • Análise molecular de rotina demonstrou um gene RHD normal • Nenhum gene híbrido presente, não era DIII e nem DVII • Sequenciamento do gene RHD: normal • Conclusão: auto-anti-D

  36. Caso Clínico • Doador com 9 doações prévias • Fenotipado como O RhD-neg em todas as doações • Na 100 doação: Suspeita de D Fraco ou Del? • Genotipagem!!!!

  37. Caso Clínico • Análise molecular demonstrou um gene RHD deletado • Nenhum D fraco, DEL e D parcial detectado • Conclusão: Doador RhD-negativo

  38. Problemas para resolver variantes RHD • Muitas regiões do gene devem ser analisadas • Geralmente requer sequenciamento do gene inteiro • Necessidade de genotipagem por microarray • Conhecimento das mudanças no gene que alteram os epítopos da proteína = clinicamente significantes

  39. Variantes RHCEProblemas na fenotipagem do antígeno C Em Africanos, Hispânicos, e grupos étnicos mistos com um gene híbrido D-CE-D específico RHD RHCE ces W16C L245V 15 % Variante ce D/Ce/D híbrido:D-negativo C-positivo Fenótipo C positivo;desenvolve anti-C Gene híbrido D-CE-D associado a variante e;desenvolve anti-e Este haplótipo RH é frequente em pacientes falciformes aproximadamente 22% Africanos

  40. Variantes RHCEProblemas na fenotipagem do antígeno e Em Africanos, Hispânicos, e grupos étnicos mistos ce “convencional” Muitos genes diferentes, todos com expressão alterada do antígeno e ces W16C L245V G336C ceMO W16C V223F ceEK M238V R263G M267K W16C ceAR M238V L245V R263G M267K I306V W16C ceBI M238V A273V L378V W16C Fenótipo e-positivo Desenvolvem anti-e e/ou anti-ce Frequentes em pacientes falciformes

  41. Antígenos Rh (D, C/c, E/e) são resistentes ao tratamento por enzimas, DTT, cloroquina Antígenos do Sistema Rh Anticorpos do Sistema Rh • Alo-anticorpos • anti-D, -E, -c, -C, -e • IgM ou IgG • reativos a 37oC, AGH, enzimas • clinicamente significantes • Auto-anticorpos • frequentes (anti-e)

  42. Anticorpos do Sistema Rh • Alo-anticorpos • anti-C associado a anti-G • Anti-C associado a anti-e • anti-E associado a anti-c • anti-e detectado em hemácias e-positivas

  43. Genótipo Fenótipo + DNA aglutinação Perspectivas TipagemRhD: positivoounegativo?

  44. Obrigado pela atenção!

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