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Crime Scene

?. DNA. Crime Scene. Konvektive Polymerase Kettenreaktion. Martina Bucher Sebastian Karpf. 14.11.2007. Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Englisch: Polymerase Chain Reaction Millionenfache Vervielfältigung von DNA Erzwungene, kontrollierte Replikation

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Presentation Transcript

  1. ? DNA Crime Scene Hauptseminar Biophysik der Systeme

  2. Konvektive Polymerase Kettenreaktion Martina Bucher Sebastian Karpf 14.11.2007 Hauptseminar Biophysik der Systeme

  3. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) • Englisch: Polymerase Chain Reaction • Millionenfache Vervielfältigung von DNA • Erzwungene, kontrollierte Replikation • DNA-Polymerase „produziert“ Kopien • In vitro PCR Hauptseminar Biophysik der Systeme

  4. Gliederung • Grundbausteine der PCR • Theoretische Grundlagen • Schritte des PCR-Prozesses • Was ist Konvektion? • Bedingungen für Konvektion • Aufbauten • Anwendungsgebiete • Zusammenfassung Hauptseminar Biophysik der Systeme

  5. Grundbausteine der PCR • DNA • Primer • DNA-Polymerase • Pufferlösung • dNTP-Mix Quelle: Wikipedia.de Hauptseminar Biophysik der Systeme

  6. DNA – Träger der Erbinformation • Doppelhelix • 4 heterozyklische Nukleobasen • Purine: Adenin und Guanin • Pyrimidine: Thymin und Cytosin • Desoxyribose • Phosphatreste • Wasserstoffbrückenbindungen Quelle: Wikipedia.de Hauptseminar Biophysik der Systeme

  7. Primer • Einsträngig • Keine Wiederholung von Motiven • Länge: 20-30 Nukleotide • GC-Gehalt: 40-60% • cfrei/cgebunden = e(-G(T)/kT) G(T) = H-TS • Schmelztemperatur Tm: G(T) = 0 • Tm = 2°C•(A+T)+4°C•(C+G) (Näherung) Quelle: Wikipedia.de, F-Praktikum, Dieter Braun Hauptseminar Biophysik der Systeme

  8. DNA-Polymerase • Allgemein: Enzyme für Polymerisation von Nukleotiden • Mit und ohne Korrektur-Funktion • Für PCR meistens Tag-Polymerase (Bakterium Thermus aquaticus) • Außerordentlich hitzebeständig Hauptseminar Biophysik der Systeme

  9. Pufferlösung und dNTP-Mix • Volumenregulation • Chemische Umgebung: • PH-Wert • Ionenkonzentration: Mg2+-Ionen für DNA-Polymerase • dNTP-Mix: Bausteine für DNA-Strang Hauptseminar Biophysik der Systeme

  10. Theoretische Grundlagen • cTemplate << cPrimer • Anstieg der Zahl der Kopien exponentiell • Zahl der Duplikate dominant • Zahl der Kopien nach n PCR-Zyklen: N = (2n-2n) • N0 mit 2n: Zahl der Produkte des 1. und 2. Zyklusses Quelle: F-Praktikum Hauptseminar Biophysik der Systeme

  11. Denaturierung Primerhybridisierung Elongation Ende des 1.Zyklus Schritte des PCR-Prozesses Hauptseminar Biophysik der Systeme

  12. Schritte des PCR-Prozesses • Denaturierung (94-96°C): Schmelzen der DNA • Primerhybridisierung (Tm-5°C): Andocken der Primer an das komplementäre DNA-Stück • Elongation (72°C): Verlängerung • Ende des 1.Zyklus Quelle: Wikipedia.de, F-Praktikum Hauptseminar Biophysik der Systeme

  13. 2. Teil: Konvektive PCR Hauptseminar Biophysik der Systeme

  14. Was ist Konvektion? Konvektion (lat. Convehere = mittragen) = Fließen von Teilchen bzw. Flüssigkeiten aufgrund von Temperaturgradienten Hauptseminar Biophysik der Systeme

  15. PCR durch Konvektion Für die Polymerase Kettenreaktion werden zyklisch-periodische Temperaturstufen benötigt  Konvektion schafft diese Zyklen! Hauptseminar Biophysik der Systeme

  16. Konvektive PCR versus Herkömmliche PCR Vorteile: • Schnelle Amplifikation • Nur 2 Temperaturen nötig • Nicht so träge, da keine großen Heizelemente benötigt werden Hauptseminar Biophysik der Systeme

  17. Konvektionsbedingungen I Wichtige Eckpunkte für Konvektion: • Fließgeschwindigkeit v • Fließlänge L • Viskosität  • Reynolds Nummer Quelle: Wikipedia.de Hauptseminar Biophysik der Systeme

  18. Konvektionsbedingungen II • Für Konvektion muss die Reynoldszahl unter 1000 liegen • Dies bedeutet: • Kleines v, Kleines L • Großes  • Zur Erinnerung: Quelle: Wikipedia.de Hauptseminar Biophysik der Systeme

  19. Konvektionsbedingungen III • Größe der Reaktionskammern müssen zwischen 100 m und einigen cm liegen Darunter: Diffusionsprobleme Darüber: nicht-laminarer Fluß • D.h. Konvektion kann über bis zu 6 Größenordnungen durchgeführt werden (L3  106) • Bei gutem Verlauf Verdoppelung der DNA nach jedem Zyklus (=Zyklusperiode) Quelle: (1), (2) Hauptseminar Biophysik der Systeme

  20. Aufbauten • Drei Beispiele für Konvektionskammern: • Kreisrohr (circular pipe) • Rayleigh-Bénard-Zelle • Zylinderzelle (cylindrical chamber) zu c) zu a) zu b) Quelle: (1), (2) Hauptseminar Biophysik der Systeme

  21. a) Kreisrohr (circular pipe) Vorteile: • gesamtes Volumen zirkuliert • niedriger Energieverbrauch (Batteriebetrieb möglich) Nachteile: • Parabolisches Fließprofil  stark unterschiedliche Perioden der Amplifikationszyklen Quelle: (1), (2) Hauptseminar Biophysik der Systeme

  22. b) Rayleigh-Bénard-Zelle Konvektionskammer zwischen 2 geheizten Platten. Es bilden sich Konvektions-Zirkulationen. Quelle: (1), (2) Hauptseminar Biophysik der Systeme

  23. b) Rayleigh-Bénard-Zelle • ΔT < ΔTkrit,1 : Viskosität überwiegt Konvektionsströmung • ΔTkrit,1 < ΔT < ΔTkrit,2 : Es treten regelmäßig geformten Konvektionszellen auf, die Bénard-Zellen • ΔTkrit,2< ΔT : Das System gelangt ins Chaos Quelle: Wikipedia.de Hauptseminar Biophysik der Systeme

  24. b) Rayleigh-Bénard-Zelle Vorteile: • einfacher-kompakter Aufbau Nachteile: • Viel Energie für Heizplatten benötigt Quelle: (1), (2) Hauptseminar Biophysik der Systeme

  25. c) Zylinderzelle Erklärung anhand der Versuchsaufbauten gefunden in: (1) „Exponential DNA Replication by Laminar Convection“ Von Dieter Braun et al., 2003 (2) „PCR by Thermal Convection“ von Dieter Braun Quelle: (1), (2) Hauptseminar Biophysik der Systeme

  26. Arbeit von Dieter Braun • Infrarotlicht (1480 nm) im Zentrum des 1mm x 5mm großen Zylinders • Umgebungstemperatur 52°C • Errechnete Reynoldsnummer für: • laminaren Fluss • Länge L  2mm • Viskosität von Wasser   1mm2/s • typische Geschw. v  0,4mm/s ergibt Re  1 Quelle: (1), (2) Hauptseminar Biophysik der Systeme

  27. Ergebnisse • Bereits nach 25 Minuten ergab sich 100.000-fache Amplifikation • DNA ließ sich durch Fluoreszenzmarker visualisieren • Gewünschte DNA-Amplifikation über Gelelektrophorese überprüft und bestätigt Quelle: (1), (2) Hauptseminar Biophysik der Systeme

  28. Visualisierung der DNA • Interkalierende Fluoreszenzmarker binden nur • an doppelsträngige DNA • Man erkennt die Amplifikation der DNA • Dunkle Stellen deuten auf Einzelstränge hin • Nach Auschalten des IR-Lichtes verschwand • der schwarze Punkt im Zentrum Quelle: (1), (2) Hauptseminar Biophysik der Systeme

  29. Visualisierung der DNA Quelle: Dieter Braun Hauptseminar Biophysik der Systeme

  30. Analyse durch Gelelektrophorese Vergleich mit DNA bekannter Länge bestätigt, dass 100bp DNA-Sequenzen amplifiziert wurden. Die Probe nach 0 min zeigt keine 100bp Sequenzen. Quelle: (1), (2) Hauptseminar Biophysik der Systeme

  31. Temperaturabhängigkeit Temperaturabhängigkeit der PCR wurde durch kontinuierliche Leistungsänderungen der Infrarotquelle bestimmt. (bei bestimmter Bahn z0=50m) Quelle: (1), (2) Hauptseminar Biophysik der Systeme

  32. Video der zylindrischen konvektiven PCR Quelle: Dieter Braun Hauptseminar Biophysik der Systeme

  33. c) Zylinderzelle Vorteile: • Sehr schnell (25 min für 100.000-fache Amplifikation) • Hohe Effizienz (50%), da gutes Strömungsverhalten • Geringe Energie benötigt (Batteriebetrieb möglich) • Nur optisch, keine Heizkontakte nötig Quelle: (1), (2) Hauptseminar Biophysik der Systeme

  34. Anwendungsgebiete • Genetischer Fingerabdruck • Vaterschaftstest • Erkennung von Krankheiten • Klonierung von Genen • Mutagenese • Analyse alter (fossiler) DANN • Geschlechtsbestimmung • Pränataldiagnostik Hauptseminar Biophysik der Systeme

  35. Zusammenfassung • PCR vermehrt exponentiell eine gewünschte DNA-Sequenz, wobei nur kurze Sequenzen amplifiziert werden können • Konvektive PCR ist high-speed PCR • Einfache Designs • Kostengünstige Möglichkeit • Sehr kleine Versuchsaufbauten möglich Hauptseminar Biophysik der Systeme

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