TESTELE DE HISTOCOMPATIBILITATE

1. TESTELE DE HISTOCOMPATIBILITATE

2. TRANSPLANTUL • = Actul de a transfera celule, tesuturi sau organe dintr-o parte in alta, fie de la acelasi individ, fie intre indivizi diferiti • Tipuri: • Autogrefa= transplantul de tesuturi proprii dintr-o parte in alta a aceluiasi individ • Alogrefa = transplantul de tesuturi de la un donor genetic diferit de acceptor, dar care apartine aceleiasi specii • Xenogrefa = transplantul de tesuturi de la un donor care apartine unei alte specii

3. ISTORIC • Secolul II: • India, autogrefa, piele, rinoplastie • Secolul III (??): • Inlocuirea membrului inferior gangrenos al imparatului Iustinian cu cel al unui cadavru • 1959: • Boston, rinichi, gemeni bizigoti • 1967: • Denver, ficat • 1968: • Cape Town, inima; Minneapolis, maduva hematopoetica

4. CONDITII TRANSPLANT • Compatibilitate AB0 • Identitate HLA cat mai mare • Absenta in serul pacientului a unor Ac anti-donor • Stimulare slaba la reactia mixta limfocitara

5. COMPATIBILITATE AB0 • Incompatibilitate minora: • Donorul are Ac (aglutinine) • Exemplu: donor 0 si primitor A/B/AB • Incompatibilitate majora: • Donorul are Ag • Exemplu: donor A/B/AB si primitor 0 • Incompatibilitate minora si majora • Exemplu: donor A/B si primitor B/A • Nu este esentiala • Obiectiv: prevenirea hemolizei post-transplant

6. COMPLEXUL MAJOR DE HISTOCOMPATIBILITATE • = MHC • La om – HLA (human leucocyte antigen) • Grup inrudit de gene pe cromozomul 6 • Roluri: • Imunitate celulara • Imunitate umorala • Mecanisme de recunoastere intercelulara • Discriminare self / nonself

7. ORGANIZAREA HLA • 3 clase HLA: • Clasa I: • Glicoproteine membranare • ~ Celule nucleate • Prezentarea Ag peptidice endogene LT citotoxice • Clasa II: • Glicoproteine membranare • CPA • Prezentarea Ag exogene LT helper • Clasa III: • Proteine cu functie in imunitate

8. GENELE HLA

9. POLIMORFISM GENIC • Clasa I: • HLA A – 451 alele • HLA B – 782 alele • HLA C – 238 alele • Clasa II: • HLA DR – 525 alele • HLA DQ – 105 alele • HLA DP – 147 alele • (HLA DM – 11 alele) • (HLA DO – 21 alele)

10. CONDITII PENTRU COMPATIBILITATE • Se testeaza cel putin 3 locusuri: • HLA-A • HLA-B • HLA-DRB1 • 6 Ag • ≥4 identice

11. CONDITII PENTRU COMPATIBILITATE

12. TESTE DE HISTOCOMPATIBILITATE • Moleculare • Serologice • Celulare

13. METODE MOLECULARE • Leucocite din sange • Extractia ADN-ului • Amplificarea genelor HLA: • PCR-SSP • PCR-SSOP • SBT • Interpretarea rezultatelor

14. PCR-SSP • PCR-SSP (Sequence Specific Primers) • Pentru HLA clasa I si II • Amplificarea genelor HLA utilizand primeri: • Rezolutie mica – se amplifica grupuri de alele • Rezolutie inalta – se amplifica alele specifice • Electroforeza pe gel de agaroza a produsilor de amplificare: • Deplasare in functie de dimensiuni • Comparare cu marker • Citirea si interpretarea rezultatelor: • Apare banda specifica doar daca exista alela

15. PCR-SSP

16. PCR-SSOP • PCR-SSOP (Sequence Specific Oligonucleotide Probes) • Amplificarea intregului exon • Hibridizarea produsului de amplificare cu secventa complementara • Vizualizarea strip-urilor cu benzi • Interpretarea computerizata • Rezolutie scazuta

17. PCR-SSOP

18. SBT • SBT (Sequence Based Typing) • Rezolutie maxima • Amplificarea genei de interes • Secventializare • Confruntare cu baza de date – alele compatibile • Detectarea unor alele noi

19. SBT

20. METODE SEROLOGICE • Utilizeaza seruri cu concentratii mari de Ac anti-HLA specifici • Femei multipare • Lichid placentar • Pacienti cu transplante de organ sau transfuzii multiple • Ac monoclonali

21. METODA DE LUCRU • Separarealimfocitelorprincentrifugare in gradient de densitate • Ser cu Ac anti-HLA in godeuri • Se adaugasuspensielimfocitara in fiecaregodeu (complexe Ag-Ac) • Se adauga complement (ser de iepure) • Daca s-au format complexe se activeazacomplementul  lizaosmotica a celulelor • Se adauga colorant vital (eozina) • Se citeste la microscop cu contrast de faza

22. INTERPRETAREA REZULTATELOR • Limfocite vii: necolorate, stralucitoare, refractile • Limfocite moarte: umflate, rosu inchis • Pentru fiecare godeu: % limfocite moarte • Martor negativ: <10% moarte • Martor pozitiv: 100% moarte

23. INTERPRETAREA REZULTATELOR • Identificarea serurilor care au reactionat cu suspensia limfocitara • Toate serurile cu specificitatea respectiva trebuie sa dea reactie pozitiva (>50% limfocite moarte)

24. TIPIZARE HLA-A Interpretare: fenotip HLA A28, A3

25. TIPIZARE HLA-B

26. SCREENING PENTRU ANTICORPI ANTI-HLA • Detectarea Ac anti-HLA din sangele primitorului • Metoda de lucru: • Suspensie de leucocite cu HLA cunoscut in godeuri • Se adauga ser de la primitor (complexe Ag-Ac) • Se adauga Ac anti-Fc • Se adauga complement (ser de iepure) • Daca s-au format complexe  se activeaza complementul  liza osmotica a celulelor • Se adauga eozina si se citeste la microscop

27. INTERPRETAREA REZULTATELOR • Limfocite vii: necolorate, stralucitoare, refractile • Limfocite moarte: umflate, rosu inchis • Pentru fiecare godeu: % limfocite moarte • Ac anti-HLA  probabilitatea de a gasi un donator compatibil

28. REACTIA MIXTA LIMFOCITARA • MLR (Mixed Lymphocyte Reaction) • LT ale unei persoane (P1) raspund la Ag HLA de pe limfocitele unei alte persoane (P2) • Stimulare Ag  proliferare limfocitara (sinteza crescuta de ADN) • Unidirectionala: se blocheaza proliferarea limfocitelor P2 si se analizeaza proliferarea limfocitelor P1 • Bidirectionala: P1 si P2 se stimuleaza reciproc si se insumeaza raspunsurile

29. TESTUL DE LIMFOTOXICITATE MEDIATA CELULAR • Se realizeaza o reactie mixta unidirectionala  populatie de limfocite citotoxice activate (P1) impotriva limfocitelor P2 • P1 se pune in contact cu limfocite P2 marcate cu 51Cr • Se masoara 51Cr eliberat (comparativ cu celule 51Cr nespecifice de la o alta persoana) • ~Simulare transplant

30. PROBLEME LEGATE DE HLA • Rejetul transplantului din cauza LT ale primitorului care recunosc HLA necompatibile • Factori care influenteaza rejetul: • Sarcina, transfuzii • Incompatibilitate HLA • Terapie pre-transplant mai putin agresiva • Terapie imunosupresoare post-transplant suboptimala • Depletia LT din grefele de maduva osoasa • Clasa I  tolerarea grefei • Clasa II  GVHD

31. REACTIA GREFA CONTRA GAZDA • GVHD (Graft Versus Host Disease) • = transplantarea de tesuturi imunocompetente (celule stem hematopoetice), necompatibile cu tesuturile primitorului in gazde imunodeprimate patologic sau farmacologic (medicatie imunosupresoare) • Celulele imune din grefa recunosc moleculele HLA ale gazdei ca fiind straine  raspuns imun impotriva celulelor gazdei

32. REACTIA GREFA CONTRA GAZDA • GVHD acut: • <100 zile post-transplant • Piele, mucoase, plamani, ficat, tract gastro-intestinal • GVHD cronic: • >100 zile post-transplant • Piele, mucoase, plamani, ficat, tract gastro-intestinal, glande exocrine, tesut conjunctiv • Corticoterapie

33. GVHD ACUT Eritem palmar

34. GVHD ACUT Ulceratii ale mucoasei bucale

35. GVHD ACUT Degenarea stratului bazal, keratinocite necrozate

36. GVHD CRONIC Papule confluente hiperpigmentate

37. GVHD CRONIC Placi sclerotice hiperpigmentate

38. GVHD CRONIC Modificari lichenoide difuze ale buzelor

39. GVHD CRONIC Hiperkeratoza, hipergranuloza, acantoza, degenerarea stratului bazal