Bacterial Staining (Gram Staining)

1. Bacterial Staining(Gram Staining) Sang-heum, Shin Hyoung-Joo, Lee Fermentation and Metabolic Lab. URL: http://www.ajou.ac.kr/~fereng/

2. 미생물의 현미경 관찰과 염색 • 학습목표 • 현미경의 원리, 종류, 사용법 • 미생물의 관찰 및 형태학적 특성 • 미생물 염색의 목적과 원리를 안다 • 염색방법의 종류와 특징을 안다 • 그람염색의 중요성과 방법을 이해하고 실습한다

3. 현미경 • 원리 • Magnification • Contrast • Resolution (‡ Resolving power) • 종류 • Bright-field microscopy • Dark-field microscopy • Phase-contrast microscopy • Fluorescence microscopy • Electron microscopy SEM (주사전자현미경) TEM (투과전자현미경)

5. 현미경을 통한 미생물 크기 측정 접안 마이크로미터 (ocular micrometer) 대물 마이크로미터 (stage micrometer)

6. 대물 마이크로미터의 눈금 수 접안 마이크로미터 1 눈금의 길이 ( ocular unit ) = x 10 μm 접안 마이크로미터의 눈금 수 1. 접안 마이크로미터 1 눈금의 길이 계산 하기 대물 마이크로미터의 눈금 수 = 1접안 마이크로미터의 눈금 수 = 10 따라서 ----- 접안 마이크로미터 1 눈금의 길이 = 1/10 x 10 = 1 μm

7. 2. 시야에 그림과 같이 보인다면 접안 마이크로미터 1 눈금의 길이와, 관찰되는 생물체의 크기는 ?(단, 점선은 대물 마이크로미터이고 실선은 접안 마이크로미터이며 대물 마이크로미터 1눈금은 10 ㎛이다.) 접안 마이크로미터 1 눈금의 길이 = 3/5 X 10 = 6 ㎛ 생물체의 크기는 = 28 X 6 = 168 ㎛

8. Bacterial morphology Rod Spherical (cocci) Herical and Curve

9. 미생물의 명명법 • Binomial nomenclature system - Latinized name. - 이탤릭체 또는 밑줄 - First word = Genus name Second word = Species name Escherichia coli

10. Microscope Techniques: Dyes & Staining • Simple (positive) staining :  basic dye (methyle blue, crystal violet, safranin O 등)을 cell을 염색 • Negative staining : nigrosin, india ink 등으로 배경을 염색 • Differential staining uses combination of dyes. • The Gram stain divides bacteria into TWO groups based upon their cell wall composition: [Gram-positive vs. Gram-negative] 1차(전) 염색 (crystal violet) → 매염제 → 탈색 → 2차(후) 염색 (safranin) [The acid-fast stain Mycobacteriumtuberculosis(결핵) and leprosy (나병) ] 1차(전)염색 (carbol fucshin) → heating → 탈색 (HCl-alcohol) → 2차(후) 염색(MB) • Specific stains: 세균 내외의 특정한 구조 염색, capsule, spore, flagella staining,

11. Cell structure • Gram positive bacteria • Gram negative bacteria

12. Gram Stain 1884년 Christian Gram 이 최초로 개발한 이후 현재는 1921년 Hucker 에 의해 시약의 안정성과 균종 감별이 개선된 방법이 사용

13. Typical Gram stain

14. 다음 주 예비보고서 • 순수배양이란 ? • 흙으로부터 미생물을 분리하는 방법. • 미생물 배양용 배지의 종류. • Serial Dilution 이란 ?

15. 미생물의 분리와 순수배양 Sang-heum, Shin Hyoung-Joo, Lee Fermentation and Metabolic Lab. URL: http://www.ajou.ac.kr/~fereng/

16. Purpose This section is designed to instruct you in • 순수배양의 의미를 이해하고 방법을 실습한다 • 미생물의 분리방법을 이해한다. • Culture transfer 방법을 다양한 배지상에서 익힌다. • 미생물 배양용 배지의 종류와 제조 방법을 익힌다.

17. Introduction • Pure culture • 의미 • 세균을 한천배지 등의 배지에서 단일종만이 존재하는 상태에서 배양하는 일 • L.파스퇴르와 R.코흐에 의하여 확립된 것으로, 어떤 세균 ·원생동물 곰팡이 등을 병원체로 확정하기 위해서는 다른 종류가 혼입되지 않는 상태에서 실험할 필요가 있다. • 방법 • solid media : streak plate • poured plate • spread plate • dilution shake culture • Liquid media : dilution method • single cell isolation • two memberedculture • 각 방법의 장점과 단점

18. Broth Agar Slant Culture transfer techniques • Agar deep • Agar plate

19. Experimental Device

20. Experimental Device incubator clean bench Stirrer Water bath centrifuge Deep freezeer Shaking incubator vortex Anaerobic jar pH meter Fermenter

21. Procedure for preparation of a pure culture Streaking Colony selection

22. 미생물의 멸균방법 Heat Filtration Chemicals 배지의 종류 Arar slants Agar deep tube Agar plate 배지제조시 주요 성분의 특징 Glucose, Peptone, Tryptone Yeast extract, Beef extract, NaCl K2HPO4, MgSO4, FeSO4, Agar 배지제조의 과정 (a) Label (b) 접종용 배지와 배양용 배지를 V 형태로 한 손에 쥔다. (b) Selected colony (c) Flame the needle or loop (d) Flame the necks of the tubes (e) Transfer : zigzag motion streaking (f) Flame the necks of the tubes (g) Recap the tubes (h) Reflame the loop or needle Medium

23. Nutrient plate 0.1% strach(전분분해효소용) 0.1% skim milk (단백질 분해효소용) 0.1% tributyrin (지질분해효소용) Balance를 이용하여 칭량 증류수 첨가, 교반기로 녹인다 pH meter로 pH를 맞춘다 Agar 첨가후, autoclave로 15분 멸균 멸균이 끝나면 48-50℃ 항온수조에 넣고 식힌다 분주 냉장고 보관 Nutrient broth 배지성분을 앞의 방법 1-3의 과정에 준하여 증류수에 녹이고 pH를 맞춘다 Dispenser로 시험관에 5ml씩 분주 Autoclave로 멸균 상온에서 냉각시킨후 냉장 보관 전분분해효소를 생산하는 고온균주의 분리 및 순수배양

24. 전분분해효소를 생산하는 고온균주의 분리 및 순수배양 • 실험방법 • 전분분해 효소 생산 미생물의 분리원 선정 • 선정된 시료를 멸균용기에 채취 • 시료를 1차 희석수에 현탁한 후, 10진 희석한 뒤 0.1% strach 함유 nutrient agar plate에 spreading • Spreading 한 배지를 55℃ 배양기에서 1-2일간 배양 • Colony 주변에 전분분해에 의한 clear zone이 형성된 균주를 nutrient broth로 옮겨 배양 • Broth에서 균주가 생육하면 nutrient agar plate에 옮긴다. • Colony가 생길때까지 반복 • 순수분리균주 glycerol(20%) stock • -20℃또는 -70℃ 냉동고 보관

25. Serial Dilution

26. 다음 주 예비보고서 • 1. 미생물 생육 단계의 특징 • 2. 미생물 생육 측정 방법 • 3. 생육에 영향을 미치는 인자

27. 미생물의 생육 측정 및 생육 영향 인자 Sang-Heum, Shin Hyoung-Joo, Lee URL: http://www.ajou.ac.kr/~fereng/Department of Molecular Science and TechnologyAjou University

28. 실험 목적 미생물의 생육 측정 방법의 종류, 원리 , 특징 Spectrophotometer 원리 Temperature, pH ,NaCl glucose concentration Optimal condition 미생물의 생육영향 인자 생육 측정 실습 생육곡선작성, 생육단계구분

29. Introduction • 미생물 생육단계의 특징 • 미생물 생육 측정 방법 • 생육에 영향을 미치는 인자 • 측정 기구

30. 유도기(lag phase) 미생물이 환경에 적응 효소 단백질이 합성 RNA 증가, DNA 일정 세포가 발육하는 시기 대수기(exponential phase) 균이 대수적으로 증가하는 시기 세대시간, 세포의 크기가 일정 세포질의 합성속도, 세포수의 증가가 비례 세포의 생리적 활성이 가장 강한 시기 물리적 화학적 처리에 대한 감수성이 높은 시기 RNA 함량은 일정, DNA 증가 정지기(stationary phase) 세포수는 최대, 생균수는 일정 영양물질의 고갈, 대사성물질의 축적 pH의 변화, 산소부족등으로 생균수는 일정 포자(spore)를 형성하는 시기 증식하는 세포수 = 사멸하는 세포수 사멸기(death phase) 생균수가 감소하고 사균수가 증가하는 시기 효소작용에 의한 DNA, RNA분해, 단백질분해, 세포벽분해, 효소 단백질 변성 등 미생물 생육 단계의 특징 • 배양 기간 동안 유도기(lag phase), 대수 증식기(exponential phase), 정지기(stationary phase), 사멸기(death phase)의 4 개의 주요 단계

31. Growth curve

32. 물리적 요건 (1) 온도 일반적으로 -10~95도 범위에서 생장 Optimum, Miminum, Maximum temperature - 저온균 (Psychrophile) - 중온균 (Mesophile) - 고온균 (Thermophile) (2) 압력 미생물은 일반적으로 1기압에서 생육 (3) 삼투압 -호당성균(고농도의 당) - 호염성균, 비호염성균, 중호염성균, 고호염성균 (4) pH - 산성 세균 (Acidophile) - 중성 세균 (neutrophile) - 알칼리성 세균 (Alkalophile) 생육에 영향을 미치는 인자 • 화학적 요인 • (1) 수분활성(AW; water activity) : • (2) 산소 • 절대 호기성균 (obligate aerobes) • 통성혐기성균 (facultative anaerobes) • -절대혐기성균 (aerophobic anaerobes) • 미호기성균 (microaerophiles) • (3) 탄산가스 • - 일부 독립 영향균 • 생물학적 요인 • (1) Metabolism(공생) • 상호 이익관계 • (2) Competition(경합) • 젖산균이 당을 발효, 젖산생성시 부패균 억제 • (3) Antagonism(길항) • 항생물질 생산균 • (4) Synergism(공동작용) • 다른 미생물이 공동으로 새로운 기능 발현

33. 건조 균체량(Dry weight) - 배양액 채취, Desicator 건조,중량측정 - 가장 보편적인 방법 - 고형성분이 없는 배지, 세포의 질량 측정 - 곰팡이나 방선균은 비탁법 등의 어려움 균체질소량 ; 균체 성분인 질소량을 측정하여 증식도를 측정하는 방법 - 균체량과 질소량이 비례한다는 가정 Packed volume 이용법 - 미생물을 Packed volume 측정용 - 원심분리관에 넣고 원심분리후, 침전되는 균체량 측정 - 배양액 중의 세포 농도를 신속히 측정 - 표준조건하에서 원심분리한 후, 세포가 차지하는 부피 측정 - 상대적인 간접법으로 균사를 생성하는 방선균, 곰팡이 등에 사용 광학적 측정법(비탁법) 광전 비색계를 이용하여 탁도(O.D:optical density) 측정하는 방법 660nm 에서 측정 총균계수법 1.계수반법(counting chamber) - heamatometer 2.입자계측기법(Coulter count) - 세포를 적당한 전해질 용액에 부유, 전기저항이 큰 세포가 구멍통과시 pulse로 나타남 3.Membane filter법 - 미생물이 통과할 수 없는 memebrane filter를 이용하여 일정량의 균액을 여과시킨 후 막 위의 세포수를 직접 계수하는 방법 - 100ml/100개 미만 생균측정법 plate counting, MPN method (희석) 균체 성분의 정량 미생물 생육 측정 방법

34. Indirect Measurements of Microbial Growth : Turbidity • 미생물의 생장을 측정하는 방법에는 미생물의 건조 중량을 직접적으로 측정하는 방법 외에도 미생물 현탁액의 탁도를 측정함으로써 간접적으로 측정할 수 있는 방법이 있다. • 광선이 미생물 현탁액을 통과할 때 산란에 의하여 생기는 투과광량의 감소가 세균의 밀도에 비례한다는 사실에 근거를 두고 있다.

35. Spectrophotometer • 파장을 600nm 로 맞춤. • 증류수를 넣어 영점을 보정한다. • 흡광도를 측정한다. • O.D(optical density) 0.2-0.8 범위내에서 측정. • 흡광도를 측정한 후 희석배수를 곱한다.

36. 이러한 투과광량의 측정은 Photometer(광도계) 또는 Spectrophotometer(분광도계)를 사용 한다.

37. Generation time • 1 개의 세포가 2개로 되는데 소요되는 시간 • 세대시간계산법, 총균수 = 초기균수 X 2세대시간X b = a X 2n (a=최초의 균수, n= 세대수, b=균수) 예) 30분마다 분열하는 세균 2마리가 3시간 후에 몇 마리가 되겠는가? 128마리 예) 어떤세균이 14시간 24분에 36회를 분열 하였다면 이 세균의 세대시간은? 24분

38. Strains Escherichia coli Medium  LB 배지 Culture condition A. pH : pH4, pH7 B. Glucose : 0%, 0.5%, 1% C. Temperature : 37, 50OC D. NaCl : 0%, 1%, 5% 37OCShaking incubator Spectrophotometer 50ml / 250ml flask Materials and Methods • Seed culture 냉동고에 보관중인 균주를 꺼내서 clean bench 에서 접종(2-3회) • Main culture 접종 후 12 h 배양 • Sampling 2h씩 총 12 h 배양 • 흡광도 측정 9ml 희석수에 배양액 1ml 첨가 • Vortex

39. 예비 보고서 • 항생물질의 종류, 작용기작 • 항생물질의 activity 측정방법 - Kirby-Bauer antibiotic sensitivity procrdure (paper disc method) - MIC (Minimum inhibitory concentration) • 소독제 – LOX

40. 항생물질에 의한 미생물 생육 억제 Sang-heum, Shin Hyoung-Joo, Lee Fermentation and Metabolic Lab. URL: http://www.ajou.ac.kr/~fereng/

41. 1928년 Alexander Fleming이 penicillin을 처음 발견되고, 1943년 스트렙토마이신이 발견된 이래, 많은 종류의 항생제가 개발되어 감염증의 주요 치료 수단으로 이용되어 왔다. 그러나 1997년에 이르러 “항생제의 마지막 보루”라고 여겨지던 Vancomycin에도 반응하지 않는 세균이 출현하여 항생제 내성 발현 억제와 새로운 항생제의 개발에 대한 관심이 고조되고 있다. • 항생제(Antibiotics)와 항균제(Antibacterials) • 항생제 내성(Antibiotic Resistance) 항생제의 사용에 따라 이에 대한 방어 수단을 지닌 내성세균이 출현하였다. 그 결과 항생제에 감수성이 큰 세균에 의한 감염증은 감소하고, 내성세균에 의한 감염증은 상대적으로 증가하고 있다. 이들 내성세균의 치료를 위해 인류는 새로운 항생제를 개발하는 노력을 끊임없이 계속하여야 할 것이다.

42. 세균의 분류 Bacteria are classified as gram positive or gram negative depending on whether or not they take up gram stain. (Hans C. J. Gram) • Gram positive bacteria • Gram negative bacteria

43. Gram-positive bacteria Gram positive bacteria retain the dye Gentian violet taken to the thick cross-linked polysaccharide. Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Enterococci Gram-negative bacteria Have additional thick outer membrane, which consists of lipopolysaccharides, proteins, and phospholipids. Neisseria meningitidis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa

44. 대표적인 항생제 및 항균제 • - b-Lactam 계 • - Aminoglycoside 계 • - Quinolone 계 • - Tetracycline 계 • - Sulfonamide와 trimethoprim 계 • - Glycopeptide 계 • 구조 및 활성 • 작용기전

45. 항생제가 세균을 어떻게 죽일까?

46. b-Lactam 계 항생제 β-Lactam 항생제로는 Penicillin, Cephalosporin, Monobactam, Carbapenem 계 등이 있다.

47. b-Lactam 계 항생제는 어떻게 작용하나? • 세포벽(cell wall)은 세균의 형태를 유지하고, 삼투압에 의한 세포의 파괴를 방지한다. 따라서 • 세균이 생존하기 위해서는 세포벽을 끊임없이 합성해야 한다. • 세포벽은 polysaccharide와 polypeptide chain 이 covalent link된 peptidoglycan으로 구성. • 전구체의 연결에는 transcarboxylase와 transpeptidase가 필요한데, 이들 효소는 penicillin과 잘 결합하는 특성이 있기 때문에 penicillin binding protein (PBP)이라 불린다. 모든 β-lactam 항생제는 이들 PBP와 결합해서 그 활성을 억제하며, 결과적으로 세포벽 합성을 억제해서 항생력을 발휘한다

48. 헛기질로서의 b-Lactam 계 항생제

49. Aminoglycoside 계 항생제 Aminoglycoside 항생제로는 Gentamicin , Micronomicin Streptomycin , Kanamycin 등이 있다. Gentamicin Kanamycin

50. Aminoglycoside 계 항생제는 어떻게 작용하나? • Aminoglycoside는 세균 ribosome의 30S subunit과 불가역적으로 결합해서 단백합성을 • 저해하는 살균성 항생제이다. • Aminoglycoside와 결합된 ribosome은 단백질합성시 mRNA를 해독 (translation)할 수 없게 된다. • 또한 aminoglycoside는 ribosome의 유전 정보 오독 (misreading)을 유도해서 • 엉뚱한 단백질을 합성하도록 하며, 이로 인해서 세균은 사멸하게 된다.