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Some suggestion for KO and complementation. Chengkang Zhang Aug.17 , 2010. KO vector. DO we need the KO vector? NO, we just need the AHB fragment, OR AH&HB fragments. SOE-PCR. 1. 技术原理.
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Some suggestion for KO and complementation Chengkang Zhang Aug.17,2010
DO we need the KO vector? NO, we just need the AHB fragment, OR AH&HB fragments.
SOE-PCR 1. 技术原理 两段基因的引物其中有两条是常规的引物,两外两条引物是特殊设计的,其序列上一端与自身的目的片段互补,另外一端却是另外一段目的基因的序列。这样经过各自的PCR克隆后,在各自的产物其中的一端加上特别的接头。然后把PCR 产物处理后,利用接头的特异互补进行PCR 扩增,从而将两段PCR 产物连接到了一起,形成了不靠限制性内切酶连接的杂交基因片段。
2. 特点 ①不需要设计酶切识别位点,将不同来源的DNA 片段连接起来。 ②不需要经过接头处理和连接酶,利用PCR 拼接基因。 ③可以进行高保真的定点、定位突变,并且突变和重组可以同时进行。 ④与反应条件性惯性大,容易产生随机突变,需要优化PCR 条件。
3. 方法 For regular gene replacement constructs 5F 6R 3F 4R 8R 7F 1F 2R Gene of Interest hph H855R H866F H852 H850 Primers 1F – 8R are gene specific primers H852: AACTCACCGCGACGTCTGTC (20 mer, 379-399) H850: TTGTCCGTCAGGACATTGTT (20 mer, 989-969) H855R: GCTGATCTGACCAGTTGC (18 mer,Reversed, 155-138) - 7F H856F GTCGATGCGACGCAATCGT (19 mer, 1238-1256) - 8R Primers H852 and H850: to confirm real transformants Primers 5F and 6R for negative screen Primers 7F and H855R for positive screen (upstream) Primers H856F and 8R for positive screen (downstream)
For the Split-Marker Approach 3F 2R 4R 8R 7F 1F 5F 6R Gene of Interest HYG/F HY/R YG/F HYG/R Primers 1F – 8R are gene specific primers. Only primers 2R and 3F are chimeric primers For 2R, add TTGACCTCCACTAGCTCCAGCCAAGCC to the 5’ of gene-specific primer sequence For 3F, add GAATAGAGTAGATGCCGACCGCGGGTTto the 5’ of gene-specific primer sequence Primer sequence in red: universal – related to the hph cassette YG/F: GATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCT HY/R: GTATTGACCGATTCCTTGCGGTCCGAA HYG/F: GGCTTGGCTGGAGCTAGTGGAGGTCAA HYG/R: AACCCGCGGTCGGCATCTACTCTATTC HYG/F - Hy/R: 798 bp (N-terminal portion of the hph cassette) YG/F –HYG/R: 918 bp (C-terminal portion of the hph cassette)
For the Split-Marker Approach Gene of Interest
FG06721 2R 1F CGTCTTCCATCTTAGACAGCGGCTTGGCTGGAGCTAGTGGAGGTCAA 3’CCGAACCGACCTCGATCACCTCCAGTT5’ HYG/F GATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCT YG/F TTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATAC HPH 3’AAGCCTGGCGTTCCTTAGCCAGTTATG5’ Split PCR HY/R 3F 4R GAATAGAGTAGATGCCGACCGCGGGTT CATTGGTAGTCGCAGTGACAG CTTATCTCATCTACGGCTGGCGCCCAA CGATCTTACTCTTCAGTGGC HYG/R Primer sequence in black: specific for gene of interest (1F, 2R, 3F and 4R) Primer sequence in red: universal – related to the hph cassette YG/F: GATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCT HY/R: GTATTGACCGATTCCTTGCGGTCCGAA HYG/F: GGCTTGGCTGGAGCTAGTGGAGGTCAA HYG/R: AACCCGCGGTCGGCATCTACTCTATTC HYG/F - Hy/R: 798 bp (N-terminal portion of the hph cassette) YG/F –HYG/R: 918 bp (C-terminal portion of the hph cassette) For 2R, add TTGACCTCCACTAGCTCCAGCCAAGCC to the 5’ of gene-specific primer For 3F, add GAATAGAGTAGATGCCGACCGCGGGTTto the 5’ of gene-specific primer
PCR 扩增A, B, hph片段(hph片段扩一次,回收后,可以用很久) • 纯化(若有杂带,需胶回收) • 不加入引物,仅靠两模板(A和hph, hph和B)互为引物,扩增8个循环左右。 • 加入AF&HY/R或YG/F&BR,扩增25个循环左右,分别可以得到AH和HB片段。(若有较多杂带,胶回收为宜) • 原生质体的转化。
目前,文辉师兄近期用此方法,很快就得到了转化所需的DNA片段。目前,文辉师兄近期用此方法,很快就得到了转化所需的DNA片段。 • 师兄在扩A,B片段时,条带是单一的,SOE后,得到的连接后的片段有少许杂带。 • 本人早前有用过此方法构建过FvHtf5的KO载体,扩增A,B片段时,不易扩增到,且有杂带;回收SOE后,还是有杂带。直接原生质体的转化,还是得到了敲除突变体。 • 可能是由于当时的hph片段是从pCX62上扩增得到,头尾序列与现在用的PCD1003上的hph略有不同,这可能影响了引物的特异性。
优点 快,顺利的话,真的很快!!! • 不足 引物设计需尽量严谨,否则可能不易扩出片段; 常有杂带。 个人意见,对于要求不是很高的基因敲除而言,此方法是很值得使用的。
使用KO-vector方法时的建议 • 第一天 • 扩增A,B片段 • 纯化即可 • 酶切,胶回收,连接 • 第二天 • 连接产物作为模板,扩增AH和HB片段 • 原生质体的转化
Complementation • 互补片段和含有所需抗性的片段或载体共转化即可,无需构建互补载体。 • 节省时间,无需酶切、回收,连接,转化等步骤,效率依然较高。 • 师兄就是这样做的,本人尚未尝试过,详询文辉师兄。
个人经验,仅供参考 • 详询文辉师兄