Some suggestion for KO and complementation

1. Some suggestion for KO and complementation Chengkang Zhang Aug.17，2010

2. KO vector

3. DO we need the KO vector? NO, we just need the AHB fragment, OR AH&HB fragments.

4. SOE-PCR 1. 技术原理 两段基因的引物其中有两条是常规的引物，两外两条引物是特殊设计的，其序列上一端与自身的目的片段互补，另外一端却是另外一段目的基因的序列。这样经过各自的PCR克隆后，在各自的产物其中的一端加上特别的接头。然后把PCR 产物处理后，利用接头的特异互补进行PCR 扩增，从而将两段PCR 产物连接到了一起，形成了不靠限制性内切酶连接的杂交基因片段。

5. 2. 特点 ①不需要设计酶切识别位点，将不同来源的DNA 片段连接起来。 ②不需要经过接头处理和连接酶，利用PCR 拼接基因。 ③可以进行高保真的定点、定位突变，并且突变和重组可以同时进行。 ④与反应条件性惯性大，容易产生随机突变，需要优化PCR 条件。

6. 3. 方法 For regular gene replacement constructs 5F 6R 3F 4R 8R 7F 1F 2R Gene of Interest hph H855R H866F H852 H850 Primers 1F – 8R are gene specific primers H852: AACTCACCGCGACGTCTGTC (20 mer, 379-399) H850: TTGTCCGTCAGGACATTGTT (20 mer, 989-969) H855R: GCTGATCTGACCAGTTGC (18 mer,Reversed, 155-138) - 7F H856F GTCGATGCGACGCAATCGT (19 mer, 1238-1256) - 8R Primers H852 and H850: to confirm real transformants Primers 5F and 6R for negative screen Primers 7F and H855R for positive screen (upstream) Primers H856F and 8R for positive screen (downstream)

7. For the Split-Marker Approach 3F 2R 4R 8R 7F 1F 5F 6R Gene of Interest HYG/F HY/R YG/F HYG/R Primers 1F – 8R are gene specific primers. Only primers 2R and 3F are chimeric primers For 2R, add TTGACCTCCACTAGCTCCAGCCAAGCC to the 5’ of gene-specific primer sequence For 3F, add GAATAGAGTAGATGCCGACCGCGGGTTto the 5’ of gene-specific primer sequence Primer sequence in red: universal – related to the hph cassette YG/F: GATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCT HY/R: GTATTGACCGATTCCTTGCGGTCCGAA HYG/F: GGCTTGGCTGGAGCTAGTGGAGGTCAA HYG/R: AACCCGCGGTCGGCATCTACTCTATTC HYG/F - Hy/R: 798 bp (N-terminal portion of the hph cassette) YG/F –HYG/R: 918 bp (C-terminal portion of the hph cassette)

8. For the Split-Marker Approach Gene of Interest

9. FG06721 2R 1F CGTCTTCCATCTTAGACAGCGGCTTGGCTGGAGCTAGTGGAGGTCAA 3’CCGAACCGACCTCGATCACCTCCAGTT5’ HYG/F GATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCT YG/F TTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATAC HPH 3’AAGCCTGGCGTTCCTTAGCCAGTTATG5’ Split PCR HY/R 3F 4R GAATAGAGTAGATGCCGACCGCGGGTT CATTGGTAGTCGCAGTGACAG CTTATCTCATCTACGGCTGGCGCCCAA CGATCTTACTCTTCAGTGGC HYG/R Primer sequence in black: specific for gene of interest (1F, 2R, 3F and 4R) Primer sequence in red: universal – related to the hph cassette YG/F: GATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCT HY/R: GTATTGACCGATTCCTTGCGGTCCGAA HYG/F: GGCTTGGCTGGAGCTAGTGGAGGTCAA HYG/R: AACCCGCGGTCGGCATCTACTCTATTC HYG/F - Hy/R: 798 bp (N-terminal portion of the hph cassette) YG/F –HYG/R: 918 bp (C-terminal portion of the hph cassette) For 2R, add TTGACCTCCACTAGCTCCAGCCAAGCC to the 5’ of gene-specific primer For 3F, add GAATAGAGTAGATGCCGACCGCGGGTTto the 5’ of gene-specific primer

10. PCR 扩增A, B, hph片段（hph片段扩一次，回收后，可以用很久） • 纯化（若有杂带，需胶回收） • 不加入引物，仅靠两模板（A和hph, hph和B）互为引物，扩增8个循环左右。 • 加入AF&HY/R或YG/F&BR，扩增25个循环左右，分别可以得到AH和HB片段。（若有较多杂带，胶回收为宜） • 原生质体的转化。

11. 目前，文辉师兄近期用此方法，很快就得到了转化所需的DNA片段。目前，文辉师兄近期用此方法，很快就得到了转化所需的DNA片段。 • 师兄在扩A,B片段时，条带是单一的，SOE后，得到的连接后的片段有少许杂带。 • 本人早前有用过此方法构建过FvHtf5的KO载体，扩增A,B片段时，不易扩增到，且有杂带；回收SOE后，还是有杂带。直接原生质体的转化，还是得到了敲除突变体。 • 可能是由于当时的hph片段是从pCX62上扩增得到，头尾序列与现在用的PCD1003上的hph略有不同，这可能影响了引物的特异性。

12. 优点 快，顺利的话，真的很快！！！ • 不足 引物设计需尽量严谨，否则可能不易扩出片段； 常有杂带。 个人意见，对于要求不是很高的基因敲除而言，此方法是很值得使用的。

13. 使用KO-vector方法时的建议 • 第一天 • 扩增A,B片段 • 纯化即可 • 酶切，胶回收，连接 • 第二天 • 连接产物作为模板，扩增AH和HB片段 • 原生质体的转化

14. Complementation • 互补片段和含有所需抗性的片段或载体共转化即可，无需构建互补载体。 • 节省时间，无需酶切、回收，连接，转化等步骤，效率依然较高。 • 师兄就是这样做的，本人尚未尝试过，详询文辉师兄。

15. 个人经验，仅供参考 • 详询文辉师兄

16. Thank you!