Carta d'identità microbiologica dell'alimento

1. Qualità Salubrità Microrganismi positivi Microrganismi negativi Carta d'identità microbiologica dell'alimento ? ? + + Microrganismi *autoctoni *inerti *alteranti * indici di contaminazione

2. Qualità microrganismi positivi Contribuiscono alla tipicità dell’alimento Sono protagonisti del processo produttivo BATTERI LATTICI: Lactobacillus helveticus, L. bulgaricus, Lactococcus lactis, L. cremoris, Streptococcus thermophilus LIEVITI:Saccharomyces cerevisiae MUFFE: Penicillium roqueforti, P. camemberti Indicatori della qualità tecnologica

3. non dannosi, presenti nelle materie prime, dove non contribuiscono all’ottenimento e/o conservazione del prodotto finito autoctoni non dannosi ma in grado di causare, se presenti in alto numero, alterazioni organolettiche, incidendo sulla conservabilità del prodotto (Pseudomonadaceae, micrococchi, lieviti, muffe) alteranti non patogeni, ma ma con lo stesso habitat e caratteristiche dei patogeni (più numerosi e più facilmente rilevabili: stafilococchi, coliformi fecali Escherichia coli) indici di contaminazione

4. Salubrità microrganismi negativi patogeni Salmonella spp. Shigella spp. Listeria monocytogenes E. coli enteropatogeno Vibrio cholereae Staphylococcus aureus Bacillus cereus Clostridium botyulinum Produzione di tossine nell’alimento o nell’organismo (carica) Presenza nell’alimento o nell’organismo (carica e suscettibilità dell’ospite)

5. Identificazione dei microrganismi Isolamento da matrici complesse *Terreno complesso *Terreno selettivo *Terreno di arricchimento *Condizioni colturali Mantenimento in coltura coltura pura Studio *Conta totale *Conta selettiva *Riconoscimento

6. Analisi microbiologiche di matrici alimentari Matrice liquida Campionamento Determinazione della carica microbica Matrice solida Prelievi in punti diversi (superficie, interno, centro, etc.) Scelta del metodo di conta Scelta e preparazione del diluente Scelta e preparazione dei terreni nutritivi Preparazione del campione Analisi Diluizioni successive e piastramento in terreno solido Soluzione fisiologica sterile : 9 g/l NaCl; sterilizzazione 1/2x1/2 Impiego di terreni complessi per la carica totale (sterilizzazione ¾ x 20): PCA per conta batterica (30 °C, 3 gg, aerobiosi/anaerobiosi) YGC per conta di eumiceti (30 °C 3-7 gg, aerobiosi) Impiego di terreni selettivi per la ricerca di gruppi microbici: ad esempio MRS per conta lattobacilli (30 °C, 3 gg, anaerobiosi) M17 per conta cocchi lattici (30 °C, 3 gg, anaerobiosi) Prelievo di una aliquota da matrice liquida: 1 ml (t.q.) Prelievo di una aliquota da matrice solida: in sacchetti sterili per Stomaker, determinazione del peso, aggiunta di 10 vol. di diluente, omogenizzazione, prelievo di aliquota: 1 ml (10-1) Diluizioni successive , piastramento per inglobamento, incubazione, rilevazione risultati, espressione della carica in UFC/gr o ml)

7. Prelievo dalle piastre di conta di colonie rappresentative mediante ansa; risospensione di ciascuna colonia selezionata in soluzione fisiologica sterile; diluizioni e piastramento; selezione di una colonia; determinazione delle caratteristiche macromorfologiche; prelievo e trasferimento in terreno di mantenimento (solido: striscio su slant per aerobi, infissione per anaerobi) Isolamento in coltura pura Preservazione della coltura pura Trapianto settimanale in terreno fresco per colture che devono essere utilizzate ; conservazione delle colture per lungo tempo mediante liofilizzazione o preparazione di brodocolture glicerinate a – 20 °C Coltura pura = ceppo microbico IDENTIFICAZIONE A LIVELLO DI SPECIE La specie batterica è l’unità tassonomica di base. E’ costituita da un insieme di ceppi che possiedono: Un FENOTIPO simile Un GENOTIPO simile Una storia FILOGENETICA correlabile Fenotipo simile = caratteristiche comuni alla specie + caratteristiche secondarie legate all’adattamento dei singoli ceppi Genotipo simile = 70 % omologia genetica >DNA/DNA Storia filogenetica correlabile = omologia di sequenza del gene codificante per l’rRNA 16 S > 97-98%

8. Criteri di identificazione tradizionale Macromorfologia Micromorfologia Reazione di Gram Metabolismo energetico Esigenze nutrizionali Esigenze colturali Pattern enzimatico Caratteristiche strutturali Fenotipo Genotipo Omologia DNA/DNA Criteri di identificazione innovativa Impiego di tecniche di indagine genetica, basate sulla possibilità di amplificare in breve tempo, regioni specifiche del cromosoma batterico PCR (Polymerase chain reaction) Studi filogenetici e genetici Appartenenza alla specie in tempi ridotti ed in modo specifico, anche per un numero elevato di isolati da identificare Le caratteristiche fenotipiche vengono studiate in un secondo tempo, solo sugli isolati di interesse, per permetterne il riconoscimento a livello di biotipo

10. Il codice genetico 64 possibili triplette Alcuni AA sono specificati da più di un codone DEGENERAZIONE DEL CODICE GENETICO per minimizzare gli effetti delle mutazioni

11. INIZIO ATG GTG TTG CTG STOP TAA TAG TGA Un gene è una sequenza di nucleotidi delimitata da una tripletta di inizio e di fine, che codifica per un prodotto. La sua trascrizione e regolazione avviene ad opera di una regione promotrice e regolatrice , situata a monte della sequenza genica. Ogni gene possiede un proprio sito promotore e regolatore. Un operone è un insieme di geni, ognuno codificante un diverso prodotto, ma regolati e trascritti da un unico promotore e regolatore, a monte del primo gene dell’operone. In questo modo la cellula risparmia…in un operone sono raggruppati geni che codificano per prodotti di cui la cellula ha bisogno nello stesso momento Promotore della trascrizione GENE OPERONE

12. Estrazione e purificazione dalle cellule batteriche Raccolta e lavaggio delle cellule Risospensione in tampone + saccarosio (6%) Aggiunta di agente litico: lisozima (pH 7-8, 37°C per 30 min) Aggiunta di tensioattivo: SDS al 20% Deproteinizzazione mediante estrazione con solventi: fenolo, CHF/isoamilico Centrifugazione e raccolta del surnatante Fase acquosa contenente il DNA Interfase Solvente Ulteriore deproteinizzazione e raccolta del surnatante Trattamenti enzimatici con RNAsi e Proteinasi Precipitazione del DNA con 2 vol. di EtOH Scioglimento del DNA in tampone

13. Quantificazione e visualizzazione spettrofotometrica Il DNA ha un massimo di assorbimento a 260 nm 1 OD260nm = 50 µg/ml Il DNA si denatura per effetto del calore = si rompono i legami H e si separano i due filamenti Per l’EFFETTO IPERCROMICO delle basi nucleotidiche, all’aumentare della separazione dei due filamenti aumenta la OD260nm

15. Visualizzazione per via elettroforetica • una molecola carica posta all’interno di un campo elettrico migra in direzione del polo di carica opposta • in un gel costituito da un polimero organico molecole di dimensioni diverse (ma di uguale carica) migrano con velocità diverse, perché le molecole di dimensioni maggiori incontrano maggiore resistenza tra le maglie di un gel È così possibile visualizzare il DNA facendolo migrare all’interno di un supporto solido (gel) e colorandolo opportunamente I REAGENTI DELL’ELETTROFORESI: Tampone : crea continuità nella vaschetta AGAROSIO: polimero che costituisce il gel Indicatore DI CORSA: permette di visualizzare la corsa ed aumenta la densità della soluzione di DNA da inserire nelle taschine del gel BROMURO di ETIDIO: si intercala tra le basi azotate delle molecole di DNA e lo ‘colora’

16. LA STRUMENTAZIONE DELL’ELETTROFORESI: 1) ALIMENTATORE: crea la differenza di potenziale 2) VASSOIO e VASCHETTA ELETTROFORETICA: vi si alloggia il gel, vi si instaura il campo elettrico

17. Il caricamento del gel

18. frammenti di lunghezza maggiore POLO - ] bande di DNA frammenti di lunghezza minore POLO + IL RISULTATO DI UNA CORSA ELETTROFORETICA VISUALIZZAZIONE MEDIANTE TRANSILLUMINATORE A LUCE ULTRAVIOLETTA (254-312nm)

20. La replicazione in vivo INTERVENGONO PER LA FORMAZIONE DELLA FORCELLA = DENATURAZIONE SINTETIZZANO I PRIMERS

21. DNA totale estratto dalle cellule = DNA stampo o templato (in opportuno tampone di reazione 5’ 3’ 3’ 5’ Separazione dei filamenti mediante DENATURAZIONE (95°C 3-5 min) 3’ 5’ 5’ 3’ Oligonucleotidi (INIZIATORI o PRIMERS) di 15-20bp + 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ FASE DI APPAIAMENTO = T di appaiamento per 30-60 ‘’ T app. =Tm (primer) – 3°C Tm = 4 x (G+C) + 2 x (A+T) =DNA polimerasi termostabile = dNTP + + FASE DI ALLUNGAMENTO = T di AZIONE DELL’E = 72-75°c per 30-60 ‘’ La replicazione in vitro: Amplificazioni di porzioni specifiche del cromosoma PCR Polymerase chain reaction

22. 5’ 3’ 3’ 5’ Fase di denaturazione Fase di appaiamento Fase di allungamento 1 ciclo 25-30 cicli = 106-107 copie • Verifica dell’avvenuta amplificazione: • gel elettroforesi • Controllo negativo

23. Costruzione dei primers 5’ TAATACTTTTT------------------------GAGATGTT 3’ 1° FORWARD 5’ TAATACTTTTT 3’ 2° REVERSE 5’GAGATGTT3’ 3’CTCTACAA5’ 5’ AACATCTC3’ APPAIAMENTO 5’ TAATACTTTTT--------------GAGATGTT3’ 3’CTCTACAAA5’ 5’ TAATACTTTTT3’ 3’ ATTATGAAAAA---------------CTCTACAA5’

24. Se una specie batterica possiede nel suo cromosoma un gene o una regione specifici, allora posso costruire una sonda specie-specifica • Devo conoscere la sequenza nucleotidica agli estremi del gene o regione specifica • Devo costruire i primers idonei • Devo estrarre il DNA batterico totale dal campione in cui devo ricercare la presenza di quella determinata specie • Devo condurre una amplificazione specie-specifica • Devo conoscere il PM dell’amplificato che mi aspetto e l’eventuale numero di copie presenti lungo il cromosoma

25. Gene his 16S rDNA lacZ reg. conserv. Gene ddl (Ala-Ala ligasi) Lactococcus lactis(933 bp) ecremoris(933 + “n” 59) Lactococcus garvieae (1100 bp) Streptococcus thermophilus (950 bp) Enterococcus faecium (650 bp) Enterococcus faecalis (940 bp) lactis

26. Se non conosco la sequenza, e non ho indicazioni sull’appartenenza a una determinata specie: . devo avvalermi di primers UNIVERSALI Geni conservati in tutti i procarioti Gene 16S rRNA

27. il sequenziamento del gene 16SrDNA Il sequenziamento viene generalmente condotto da tecnici specializzati e fornito sotto forma di cromatogramma. Una sequenza parziale delle prime 500 bp del gene, può essere sufficiente per determinare la specie di appartenenza del ceppo allo studio, tramite comparazione in banca dati con le sequenze note riportate. Ricordiamo che due ceppi appartenenti alla stessa specie devono possedere una % omologia 16S rDNA >97-98%

28. Il gene 16S rRNA si trova all’interno dell’OPERONE RIBOSOMALE P T 16S 23S Regione spaziatrice Posso usare sempre Primers Universali La RS è la parte più variabile dell’operone ribosomale posso distinguere generi e specie diverse in funzione del numero e del peso molecolare degli amplificati ottenuti Ci possono essere sul cromosoma più operoni ribosomali La lunghezza della RS può essere differente sia nell’ambito dello stesso ceppo che tra ceppi diversi

29. E. sulfureus E. gallinarum E. avium E. faecium E. durans Enterococcus sp. E. faecalis RSA 1 2 3 4 5a 5b 5c 5d M • nell’ambito lattiero-caseario: • 380 bp L. lactis • 410 bp L. garvieae • 350 bp S. thermophilus • 500 bp ?? • a) b) c) d) 2 amplificati 300-500 bp Enterococcus spp. I risultati vanno verificati con sonde specie-specifiche o con riassociazione molecolare DNA/DNA o con il sequenziamento del gene 16S rRNA.