The functional relationship between co-repressor N-CoR and SMRT in

1. The functional relationship between co-repressor N-CoR and SMRT in mediating transcriptional repression by thyroid hormone receptor α Presentado por: Dardo N. Ferreiro Ariel Waisman Federico M. Ibarbalz

2. Introducción • Hormonas tiroideas • Receptores de hormonas tiroideas (TRs): regulación de la transcripción. • Monómeros, homodímeros o heterodímeros con RXRs • Elementos de respuesta positivos o negativos (TRE o nTRE) • Proteínas co-represoras SMRT (Silencing Mediator of Retinoid and • Thyroid Hormone Repressor) y N-CoR (Nuclear Receptor Co-Repressor); • Complejos con HDAC de tipo 1(reclutan deacetilasas de histonas, • induciendo el empaquetamiento del DNA) • Conservación evolutiva • Los Recepetores Nucleares y familias de proteínas altamente • relacionadas: co-represores y co-activadores

3. Una de las hormonas tiroideas Dinámica propuesta

4. Preguntas • ¿SMRT y N-CoR tienen funciones redundantes? • ¿Se afectan mutuamente en su reclutamiento? • ¿Que sucede con TR cuando no están presentes los co-represores? ¿Qué se realizó? • Identificación de múltiples genes target de TR • Determinación de ciertos detalles en la relación entre SMRT, N-CoR • y TR y el efecto sobre la transcripción de estos diferentes genes • Descripción de la situación sin co-represores, en cuanto a • co-activadores y acetilaciones de histonas

5. Métodos Experimentales Cultivo celular: Tratamiento con siRNA RT-PCR ChIP Real Time PCR

6. RT-PCR • 1. Extracción del ARNm • 2. Restrotranscripción de la mezcla de ARNm • 3. Amplificación con primers específicos • 4. Meditación y conclusión

7. ChIP

8. Real Time PCRPCR cuantitativa • 1. Extracción del ARNm • 2. Retrotranscripción de la mezcla de ARNm • 3. Amplificación con primers específicos, asociada a fluorescencia • 4. Detección de la fluorescencia • 5. Meditación y conclusión

9. RESULTADOS ¿Ambos N-CoR y SMRT son necesarios para la eficiente represión de genes blanco de TR? En trabajos anteriores los autores demostraron que silenciando tanto N-CoR como SMRT, mediante siRNA, se des-reprimía la expresión del gen D1, regulado por TR. Para determinar si el aumento en la expresión de estos genes por el silenciamiento de los co-represores es un mecanismo general o un evento gen-específico, lo primero que se propusieron fue identificar genes adicionales regulados por TRα en células HeLa. Para realizar sus experimentos, utilizaron una línea celular HeLa α2, que expresa de forma estable TRα con un FLAG, a diferencia de la línea parental de células HeLa, que no lo expresa.

10. RESULTADOS Como control, primero verifican que la línea HeLa α2 expresa el receptor con el FLAG, mientras que la línea HeLa no lo hace. Línea HeLa α2 expresa el TR flageado, mientras que la línea parental HeLa no lo hace

11. TR RESULTADOS Identificación de genes adicionales regulados por TR Analizaron un grupo de 18 genes, cuya expresión se sabía estaba regulada por TR en hígado de ratón. Realizan una RT-PCR semicuantitativa contra los transcriptos de estos genes Identificaron que 5 de estos, además de D1, eran significativamente inducidos luego del tratamiento con la hormona T3. Como control, se ve que en células HeLa, que no expresan TR, no se produce esta inducción.

12. RESULTADOS A lo largo del trabajo analizarán que ocurre cuando se hace el knockdown contra N-CoR y SMRT, utilizando siRNA Para analizar el efecto y la eficiencia de los distintos siRNA, tratan a células HeLa α2 con distintas concentraciones de estos y analizan la presencia de proteína por WB. Usando una concentración de 20nM de siRNA se silencia totalmente SMRT y en un 80% N-CoR, funcionando también el tratamiento combinado. Como control, usan HDAC3, que no muestra cambios.

13. Estos 4 genes están regulados por TR y N-CoR está involucrado en la represión de su expresión. No cambia su expresión. Probablemente utiliza otros co-represores. RESULTADOS De forma preliminar, estudian que ocurre cuando se silencia N-CoR sobre estos genes.

14. RESULTADOS Concluyen que los genes Spot14, BCL3, FAS y ADRB2 están regulados por TR y que su actividad está asociada a N-CoR. Como ya se dijo, en trabajos anteriores los autores demostraron que TRα sin ligando podía activar parcialmente la expresión del gen D1 cuando no estaba asociado a los co represores. Analizaron luego qué pasaba con los niveles transcripcionales de estos genes luego de anular la expresión de los co-represores, mediante la técnica real time PCR. Como control midieron la tasa transcripcional de GAPDH.

15. RESULTADOS

16. RESULTADOS Vieron que el aumento en la expresión era de entre 8 a 10 veces cuando se silenciaban N-CoR y SMRT, y de aproximadamente 12 veces cuando se silenciaban los dos co-represores. Para asegurarse de que el efecto del knockdown de los co-represores es mediado por TRα, hicieron un experimento similar en células HeLa. El knockdown de estos no tuvo efecto en la expresión de estos genes en células HeLa que no expresan el TR.

17. Conclusión parcial Al menos para los genes puestos a prueba, tanto SMRT como N-CoR son necesarios para la eficiente represión de múltiples genes blanco de TR.

18. RESULTADOS The identification of TR-binding sites in TR target genes • Buscado de posibles TREs por medio del programa TRANSFAC • ChIP para confirmar si hay pegado de TR a esos sitios + • PCR con primers especialmente diseñados para cada zona: • fragmentos de 150-300 bp. • ChIPs adicionales contra N-CoR y SMRT para hallar correlación • con el ChIP de TR.

19. RESULTADOS The identification of TR-binding sites in TR target genes

20. Conclusión parcial Los co-represores N-CoR y SMRT son reclutados a varios genes target de TR por medio de TR sin ligando.

21. RESULTADOS SMRT and N-CoR are independently recruited to various TR target genes • Ensayos con anticuerpos y siRNA contra los N-CoR y SMRT • muestran desrepresión por TR • Para obtener mayor detalle al respecto, se observó el efecto de • siRNA dirigidos contra N-CoR sobre el reclutamiento de SMRT y • viceversa • ChIPs contra TR, N-CoR y SMRT sobre el promotor D1, FAS y • ADRB2

22. RESULTADOS SMRT and N-CoR are independently recruited to various TR target genes

23. Conclusión parcial SMRT y N-CoR son reclutados de manera independiente a los genes target.

24. RESULTADOS El receptor sin ligando y sin co-represores es incapaz de reprimir el gen D1 e interactúa con co-activadores Posteriormente se enfocaron en determinar por que el silenciamiento de N-CoR y SMRT lleva a la des-represión del gen D1 Compararon el nivel de acetilación en los promotores de D1 y de GADPH en células tratadas con siRNA control y siRNA contra N-CoR y SMRT.

25. RESULTADOS El silenciamiento de SMRT o de N-CoR aumenta los niveles de acetilación de histonas H3 y H4 en el promotor de D1, pero no en el del control GAPDH. Esto apoya la idea de que el receptor sin co-represores estaría asociado con histonas acetiladas.

26. RESULTADOS Luego se proponen analizar si el receptor sin ligando y libre de co-represores se une a las colas de las histonas. Para esto, transfectan 20 nM del N-CoR siRNA en células HeLa α2 y realizaron ChIP y re-Chip con anticuerpos anti TR y anti H3. El silenciamiento de N-CoR no tiene efecto sobre TR, pero se ve que este se encuentra más asociado a H3 acetilada. Esto sugiere que la región de unión del TR sin ligando en el gen D1 podría estar acetilada en ausencia de un co-represor.

27. RESULTADOS Se propusieron analizar si un aumento en el reclutamiento de co-activadores resultaba en un aumento en la acetilación de histonas. Para esto, trataron células HeLa α2 con o sin siRNA contra SMRT y N-CoR, tanto solas como en combinación. Tres días después, se les realizó ChIP contra TRα y luego se realizaron ensayos de re-ChIP contra los co-activadores SRC-1, -2 and -3, p300 y TRAP220.

28. En ausencia de co-represores, TR se encuentra unido al co-activador p300 RESULTADOS

29. Conclusión parcial En su conjunto, estos resultados apoyan la idea de que p300 se une al receptor sin ligando y sin co-represores y que esto resultaría en un aumento en la acetilación de histonas.

30. RESULTADOS Both N-CoR and SMRT are functionally redundant in mediating repression Knockdown de SMRT Sobreexpresión de N-Cor (plásmido de expresión myc-N-Cor) ¿Restauración de la represión?

31. RESULTADOS Both N-CoR and SMRT are functionally redundant in mediating repression Aumenta el pegado de N-Cor

32. Conclusión parcial Hay cantidades limitadas de los co-represores en las células a2 Este pool limitado explicaría la desrepresión observada cuando se realiza un knock down de alguno de los dos co-represores

33. Discusión • En la regulación transcripcional se ve una relación entre las familias de proteínas y su función. Las altamente relacionadas SMRT y N-CoR funcionan como co-represores, mientras que miembros de la familia SRC funcionan como co-activadores. • No se había abordado el tema de si la función entre N-CoR y SMRT era diferencial o redundante. Los estudios realizados con los genes regulados por TR muestran que ambas son necesarias para una eficiente represión. • Se identificaron sitios de unión de TR en los genes estudiados

34. Demostraron también que los co-represores N-CoR y SMRT son reclutados independientemente en los genes regulados por TR estudiados • Se observó que el silenciamiento de N-CoR produce un incremento en el nivel de acetilación de H3 en el gen D1. Esto sugiere que el receptor sin ligando y libre de co-represores se encontraría asociado a histonas acetiladas. • El silenciamiento de los co-represores conllevó a un aumento en el reclutamiento del co-activador p300. Esto podría resultar en la hiper-acetilación de las histonas resultando en una des-represión de la transcripción. • Por último, la sobreexpresión de N-CoR en células silenciadas de SMRT causa un aumento en la represión de la expresión. Esto sugiere que estos co-represores son funcionalmente redundantes y que un bajo pool de estos en la célula es lo que explica la des-represión luego de silenciar alguno de ellos en células HeLa α2

35. FIN SMRT