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INGENIERÍA GENÉTICA DE RUTAS CATABÓLICAS (Evolución experimental de rutas)

INGENIERÍA GENÉTICA DE RUTAS CATABÓLICAS (Evolución experimental de rutas). ¿Porqué es necesario? ¿Cómo se hace? Aplicaciones (ejemplos) Bioseguridad. (Se degradan). Biogénicos. Dos grupo de compuestos. Biotransformantes. Xenobióticos. Recalcitrantes. (No se degradan). COOH. COOH.

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INGENIERÍA GENÉTICA DE RUTAS CATABÓLICAS (Evolución experimental de rutas)

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Presentation Transcript

  1. INGENIERÍA GENÉTICA DE RUTAS CATABÓLICAS (Evolución experimental de rutas) ¿Porqué es necesario? ¿Cómo se hace? Aplicaciones (ejemplos) Bioseguridad

  2. (Se degradan) Biogénicos Dos grupo de compuestos Biotransformantes Xenobióticos Recalcitrantes (No se degradan)

  3. COOH COOH COOH CL CL CL Mineralización Biotransformación Recalcitrancia A) B) C) Substrato Crecimiento Producto 0 1 2 0 1 2 0 1 2 Tiempo (Unidades)

  4. ¿Porqué? Muchos compuestos tóxicos YA son degradados por cepas naturales. Sin embargo, y para algunos compuestos concretos (organoclorados, organofosforados), la velocidad de degradación por organismos naturales es muy baja. Para moléculas muy complejas (y de aparición reciente en la naturaleza), NO es de esperar que UNA SOLA cepa tenga TODA la ruta necesaria para degradarla. En estos casos, se plantea CONSTRUIR CEPAS MEJORADAS para expandir las características naturales

  5. AMPLIAR RUTA PREEXISTENTE Identificar pasos NO permisivos o cuello de botella Reclutar enzimas isofuncionales Mutagenizar y seleccionar enzimas con más amplio espectro de sustrato Añadir pasos a ruta preexistente Eliminar actividades NO deseadas "Adecuación" del regulador CONSTRUIR RUTA NUEVA Diseñar secuencia de pasos enzimáticos necesarios Reclutar las enzimas de distinta fuente CONSTRUCCIÓN DE RUTAS HÍBRIDAS

  6. ¿Cómo? Ingeniería de rutas Objetivo final:MEJORAR LAS CEPAS BACTERIANAS • Ganancia de función • Modificación de función • Pérdida de función Pasos limitantes más frecuentes: Especificad de las enzimas Fallo en la activación por el regulador Metodología: -MUTAGÉNESIS (para ganancia o pérdida de función) - al azar (requiere selección posterior) - dirigida -TRANSFERENCIA DE GENES - CONJUGACIÓN y recombinación - TRANSFORMACIÓN - y recombinación (ADN libre se integra en el cromosoma) - plásmidos (unidades replicativas independientes) -SELECCIÓN EN QUIMIOSTATOS

  7. Rif+ Rif- B A La bacteria receptora A, resistente a rifampicina, no puede crecer con catecol La bacteria donadora B, sensible a rifampicina, lleva plásmido con genes que metabolizan el catecol CONJUGACIÓN Rif+ Rif- B A SELECCIÓN (Rif + catecol) Rif+ Rif+ B Rif- A A RECEPTORA DONADORA TRANSCONJUGANTE

  8. TRANSFORMACIÓN genA(o varios genes) + Ap Plásmido manipulado oriV Bacteria Electrochoque o CaCl2 + Selección A Bacteria con función adicional Proteína A

  9. A A A C C C D D D E E E EVOLUCIÓN DE RUTAS CATABÓLICAS S A’ A’ B B B B HORIZONTAL VERTICAL

  10. EJEMPLO 1 ELIMINACIÓN BIOLÓGICA DE ALTAS CONCENTRACIONES DE NITRATO EN EFLUENTES DE FABRICACIÓN DE EXPLOSIVOS Producción de DNEG  Aguas residuales con alta carga de nitrato • Aislamiento de organismos tolerantes a altas concentraciones de nitrato. • Caracterización. • Establecimiento de las condiciones óptimas para la eliminación de nitrato. • Optimización del proceso (económica): Dilución de las aguas. Suministro de nutrientes. Fuente de carbono exógena. • Mejora genética de la cepa.

  11. 10 g de suelo en medio mínimo GLICEROL/NITRATO SIEMBRA (24, 48, 72 H) 40 TIPOS DIFERENTES CULTIVO PURO PURIFICACIÓN AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS a

  12. SELECCIÓN Se analizan los 40 clones: Tiempo de generación (velocidad de crecimiento) Tolerancia a nitrato Eficiencia de eliminación de nitrato Baja acumulación de nitrito En etilenglicol Nitrito Reductasa Nitrato Reductasa 2e¯ 6e¯ NO2¯ NO3¯ NH4+ En glicerol nasA nasB “Clon AH1” Arthrobacter globiformis “Clon 15” Klebsiella oxytoca N orgánico a a

  13. Nitrito Reductasa Nitrato Reductasa 2e¯ 6e¯ NO2¯ NO3¯ NH4+ nasA nasB 18 18 16 16 14 14 12 12 10 10 8 8 amonio (mM) nitrito (mM) 6 6 4 4 2 2 0 0 10 10 20 30 20 30 tiempo (h) tiempo (h)

  14. oriT Plac R Nitrito Reductasa Nitrato Reductasa R 2e¯ 6e¯ NO2¯ NO3¯ NH4+ nasA nasB pUPE2 nasB 9.552 kb Gen nasB de K. pneumoniae 18 18 KpnI KpnI 16 16 14 14 12 12 10 10 nitrito (mM) 8 8 6 6 4 4 2 2 amonio (mM) 0 0 0 0 10 20 30 tiempo (h) 10 20 30 tiempo (h)

  15. EJEMPLO 2 DEGRADACIÓN BIOLÓGICA DE TNT(para aplicar en fábrica de explosivos) Explosivo militar y civil Almacenado desde la segunda guerra mundial (Alemania, USA). En desuso. Pérdidas en los embalajes de almacenamiento, desertización- Enriquecimiento y aislamiento de cepas (C1S1, Clon A) Selección de C1S1. TNT sólo es fuente de nitrógeno. Selección de ClonA (crecimiento rápido en TNT). Caracterización Fuentes de carbono óptima. Temperatura. Requerimiento de oxígeno. Crecimiento con TNT. Actividades enzimáticas. Crecimiento en aguas de la factoría. Metabolismo. Cultivo contínuo No utiliza el TNT como fuente de carbono. Construcción de cepas híbridas

  16. CH3 CH3 CH3 Clon A NO2 NO2 NO2 NO2 CO2 + H2O NO2¯ NO2 NO2 tolueno tolueno tolueno TNT TNT OH OH OH OH CO2 + H2O CO2 + H2O Plásmido TOL de P. putida COOH COOH benzoato benzoato catecol catecol C C H H 3 3 NO2¯ Transferir plásmido TOL al Clon A

  17. TNT como fuente de C y N Crecimiento ClonA Tiempo (días) 0 3 6 9 ClonA + TOL

  18. CH3 NO2 Nitro-tolueno EJEMPLO 3 MINERALIZACIÓN DE MONONITROTOLUENOS Objetivo: Conseguir una cepa capaz de degradar p-nitrotolueno Las Enzimas de la ruta upper de degradación de tolueno de P. putida TOL puede llevar el p -nitrotolueno hasta nitrobenzoato. El activador XylR NO reconoce ap-nitrotolueno como activador. Ruta metaNO puede llevar el nitrobenzoato hasta CO2 + H2O. Necesitamos: Alterar el regulador XylR para que SÍ reconozca p-nitrotolueno y sea capaz de poner en marcha la ruta. Encontrar el segundo segmento de la ruta: nitrobenzoato hasta CO2 + H2O.

  19. P. putida mt -2 pWW0 (ruta meta) ELEMENTO DE CONTROL: Regulación metabólica en TOL 3-metilbenzoato ¡ l Reguladores + Pu xylUWCMABN Pm xylXYLTEGFJQKIH xylS Ps2 Ps1 Pr1 Pr2 xylR - + + + upper meta o n n tolueno 4NT

  20. CH2OH CH3 CH3 A B C D NO2 1050 110 1900 2110 2600 3380 900 400 172 Glu  Lys 85 Pro  Ser 135 Asp  Asn Mutagénesis química Regulador - 3-MBA 4NT XylR 180 XylR6 1150 XylR49 1500 XylR7 150

  21. P. putida 2440 (pWW0Pm) P. fluorescens 410PRif (pWW0Pm) + xylR6 P. fluorescens 410P C H 3 CH3 COOH COOH N O NO2 2 NO2 NO2 CH2OH CH2OH COOH COOH NO2 NO2 NHOH NH3 NHOH X CHO COOH NH3 CHO COOH OH NO2 OH NO2 OH Rotura del anillo OH Rotura del anillo COOH COOH CO2+H2O CO2+H2O NO2 NO2

  22. COOH CH2CH3 EJEMPLO 4 EXPANSIÓN DE LA CAPACIDAD DE DEGRADAR ALQUILAROMÁTICOS EL CASO DEL ETILBENZOATO Ruta TOL de P. putida puede degradar muchos derivados alquilados del benzoato, pero no etilbenzoato. Las limitaciones son: El etilbenzoato NO es efector del regulador XylSno se activa la ruta. La catecol 2,3-dioxigenasa se INACTIVA con etilcatecol. Estrategia Mutagenizar el regulador XylS para que pueda reconocer etilbenzoato Mutagenizar la cateco 2,3 dioxigenasa para que pueda “romper” etilcatecol

  23. 3-metilbenzoato OH COOH CO2 + H2O COOH COOH COOH OH Efector + Sustrato CH3 CH3 CH2CH3 CH2CH3 CH2CH3 No es efector No es sustrato OH OH xylS* OH OH CH2CH3 CH2CH3 xylE xylE* CO2 + H2O

  24. E E H H Pm Ap Tet pJLR100 pBR322 Ap Ligación EcoRI-HindIII E H Ap Pm Tet pJLR200

  25. Pm Pm Ap Ap xylS Tc Tc pNM 185 pJLR 200 pJLR 200 xylS4 pRD4 Km E.coli (pNM 185) (pJLR 200) Ap,Km,Tc,4EB,EMS . . . . . . . . Km Ap,Km Ap,Km,Tc Ap,Km,Tc,4EB Tc-r en 3MB Tc-s en 4EB

  26. pWW0 pWW0 pERD4 pERD4 Km Km P.putida (pWW0) (pRD4) 4EB,EMS D L E . . . . . . . xylS4 4EB 3MB 4MB 3MB+ 4MB+ 4EB- D L E* xyylS4 P.putida (pWW0-EB)(pRD4)

  27. EJEMPLO 5 COMPETENCIA ENTRE CEPA MANIPULADA Y CONSORCIO Degradación de naftalenosulfonato Se pretende comparar la eficiencia de un consorcio con la de una cepa manipulada genéticamente. Uno de los miembros del consorcio degrada naftaleno sulfonato hasta salicilato. El otro miembro del consorcio lleva salicilato hasta el ciclo de Krebs. La cepa manipulada puede mineralizar naftalenosulfonato La velocidad degradadora de ambos sistemas es equivalente. ¿Cómo compiten?

  28. SO3H OH OH OH CHO COOH COOH OH OH COOH Sphingomonas BN6 Consorcio P. putida NCIB9816 Sphingomonas BN6 OH pWW60-3026 OH Cepa manipulada CO2 + H2O

  29. COMPETENCIA EN QUIMIOSTATO 1010 109 Cepa manipulada Nº de células 108 P. putida 107 BN6 106 0 5 10 15 Tiempo (días)

  30. Reclutamiento adicional de la -lactona isomerase Reclutamiento de la benzoate 1,2-dioxygenase B13 3CB 4CB 4MB 3CC OAA TCA 3CB 4CB 4MB 3CC 4CC4MC OAA OAA º TCA TCA 3CB 4CB 4MB 3CC 4CC 4MC OAA OAA  -L TCA TCA TCA  -L  -L CONSTRUCCIÓN DE CEPA CAPAZ DE DEGRADAR CLORO-Y METIL BENZOATOS B13 B13 B13

  31. EXISTEN PROBLEMAS LEGALES PARA LA LIBERACIÓN AL MEDIO DE ORGANISMOS MANIPULADOS GENÉTICAMENTE NECESITAMOS SISTEMAS DE CONTROL

  32. SISTEMAS DE CONTROL DE MICROORGANISMOS MANIPULADOS GENÉTICAMENTE OBJETIVO: queremos que la cepa manipuLada desaparezca una vez que ha cumplido su función: contención biológica. • Construcción de cepas de Pseudomonas putida portadoras de un sistema activo de contención biológica • Caracterización del proceso de lisis en P. putida tras la inducción de la muerte celular • Validación en microcosmos de las cepas construídas ESTRATEGIA: diseñar un sistema de muerte programada Buscar elemento matador Elegir elemento regular Ensamblar los componentes e introducirlos en la cepa de interés.

  33. SISTEMA ACTIVO DE CONTENCIÓN BIOLÓGICA ELEMENTO MATADOR ELEMENTO REGULADOR Gen regulador P P Gen letal + La proteína reguladora impide la expresión del gen letal Señal externa

  34. GENES MATADORES • Nucleasas • Proteínas tipo porinas • Gen gef de E. coli • Colapso del potencial de membrana • Liberación de ARNasa periplásmica • Permeabilización a iones Mg2+ • Gen E del fago X174 • Formación de túnel transmembrana • Liberación del contenido citoplásmico

  35. Gen gef

  36. P. putida mt -2 pWW0 (ruta meta) ELEMENTO DE CONTROL: Regulación metabólica en TOL 3-metilbenzoato ¡ l Reguladores + Pu xylUWCMABN Pm xylXYLTEGFJQKIH xylS Ps2 Ps1 Pr1 Pr2 xylR - + + + upper meta o n n tolueno

  37. ELEMENTO REGULADOR ELEMENTO MATADOR Gen matador Supervivencia xyl S P lac - + lac I I I SI S S S I I I 3MB xyl S P lac I lac Pm Pm lac I SISTEMA REGULADO DE CONTENCIÓN BIOLÓGICA NO a a a a

  38. ENSAMBLAJE DE LOS ELEMENTOS

  39. Cepas contenidas biológicamente P. putida Elemento matador Elemento control Cepa de Pm xylS 2 lacI EEZ30 gef R P T c A 1 - 0 4 / 0 3 R Km pCC102 o r i 1 4 . 7 k b n i c CMC12 R P gen E T el A 1 - 0 4 / 0 3 m o b a a a a a a

  40. nm 660 (DO celular Crecimiento P. putida CMC12 Cepa control ) glucosa 3MB 1 3MB 0.1 glucosa 0.01 0 4 8 12 16 20 24 0 4 8 12 16 20 0

  41. P. putida CMC4 (pWW0) P. putida CMC12

  42. P. putida CMC12

  43. OTRAS TÉCNICAS DISPONIBLES Ingeniería de proteína DNA shuffling Sistemas asociados a la raíz (rizorremedio) Sistemas asociados a biofilms EN TODOS LOS CASOS, HAY QUE CONOCER EL FUNCIONAMIENTO DE LOS SISTEMAS

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