ADENOVIRUS

1. ADENOVIRUS 1953 identificazione di un virus come causa del processo degenerativo di colture cellulari derivate da adenoidi umane 1954 dimostrazione di effetto citopatico in colture di tessuto infettate con secrezioni dell’apparato respiratorio 1956 studi epidemiologici confermano l’origine virale dell’agente eziologico delle malattie acute dell’apparato respiratorio. Virus simili causano congiuntiviti e gastroenteriti infantili

2. ADENOVIRIDAE più di 100 membri

3. Adenovirus umani SottogruppiTropismo cellulareSierotipi A tratto GI 12, 18, 31 B polmoni, tratto urinario 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35, 50 C alte e basse vie dell’apparato respiratorio 1, 2, 5, 6 D tratto GI, occhi 8,10, 13, 15, 17, 19, 20, 22,30, 32, 33, 36,39, 42,49, 51 E tratto respiratorio 4 F-G tratto GI 40, 41 virus generalmente poco patogeni infezioni lievi ed autolimitanti

4. STRUTTURA DEGLI ADENOVIRUS 70-100 nm Core : ds DNA - covalentemente legato alla proteina TP - complessato alla proteina VII proteina X (proteasi) proteina V core proteasi Capside (252 capsomeri) 240 esoni : trimeri di proteina II 12 pentoni : Base (pentameri di proteina III) Fibra (trimeri di proteina IV) 70-90 nm proteina IIIA esoni che circondano i pentoni proteina IX esoni delle facce proteina VI ancora l’anello di esoni che circondano ipentoni con il core proteina VIII ancora gli esoni delle facce al core

5. ITR ITR SEQUENZE ITR (100bp) Il GENOMA degli ADENOVIRUS (ds DNA: 30-36 Kb) regione ORI (replicazione del genoma) regioni di controllo trascrizionale siti di legame per fattori trascrizionali e proteine enhancer cellulari : NF-I e Oct-I sequenza di impacchettamento

6. Penetrazione di Adenovirus • entrata mediata da endocitosi clatrina-dipendente • Perdita delle fibre Lisidella membrana degli endosomi mediato dalla proteina della base dei pentoni • A livello dei pori nucleari la struttura capsidica subisce un disassemblaggio parziale : - perdita dei pentoni III e della proteina IIIa - dissociazione della proteina VIII - degradazione proteolitica dellaproteina VI da parte della proteasi presente nel virione (adenina) -perdita della proteina IX pH

7. liberazione del DNA virale complessato alla proteina VII PENETRAZIONE DEL GENOMA

8. 50 proteine geni precoci geni tardivi ESPRESSIONE GENICA degli ADENOVIRUS E- geni precoci L- geni tardivi

9. I GENI PRECOCI E1A/B E2A/B E4 E3 ITR ITR

10. GENE E1A mRNA 13S proteina 289R mRNA 12S proteina 243R trans-attivatori trascrizionali di geni virali e cellulari • progressione del ciclo cellulare • - legame con pRb (Retinoblastoma tumor suppressor protein) induzione di apoptosi - stabilizzazione di p53

11. Ruolo di pRb nella regolazione della proliferazione cellulare E1A

12. E1A E1A p14

13. GENE E1A mRNA 13S proteina 289R mRNA 12S proteina 243R trans-attivatori trascrizionali Alterano la progressione del ciclo cellulare: Stimolano la replicazione del DNA virale • Bloccano la risposta ci difesa cellulare: • inibizione di STAT1 • - inibizione di IKK

14. Proteine E1B 55 kDa- lega, inibisce e induce la degradazione di p53 19 kDa - omologo di Bcl2 (inibisce oligomerizzazione di Bax Stabilizzazione, esporto e traduzione preferenziale dei trascritti virali. Inibizione della sintesi proteica della cellula ospite.

15. E1A pRB g geni proliferativi a IKK E1A b IB E1B 19kd NF-kB risposta innata E1B 55kd p53 geni pro-apoptotici MECCANISMO DI TRASFORMAZIONE CAR integrine

16. ESPRESSIONE GENICA VA ITR E1A/B E2A/B E4 ITR E3 L1 L2 L3 L4 L5 E2A - ssDBP) E2B - pTP (80KDa) e DNA polimerasi virale replicazione del DNA trascrizione dei geni late in sinergia con fattori trascrizionali

17. ESPRESSIONE GENICA VA ITR E1A/B E2A/B E4 ITR E3 L1 L2 L3 L4 L5 proteine che regolano la risposta della cellula ospite all’infezione

18. ESPRESSIONE GENICA VA ITR E1A/B E2A/B E4 ITR E3 L1 L2 L3 L4 L5 proteine che regolano la trascrizione del virus e promuovono lo shut-off della sintesi proteica cellulare

19. Virus-Associated (VA) RNA 1 o 2 trascritti lunghezza: 200 basi codificati dalla Polimerasi III della cellula ospite VAI VA inibizione della dimerizzazione di PKR - mantenimento della sintesi proteica - inibizione delle difese anti-virali

20. CICLO DI REPLICAZIONE

21. REPLICAZIONE DEL DNA DI ADENOVIRUSla sequenza Ori La sequenza Ori: sequenza ricca di AT per facilitare lo srotolamento del DNA localizzata vicino a regioni di legame di fattori trascrizionali (aumento dell’efficienza di replicazione) proteinaTPlegata al terminale 5’ di ogni filamento

22. - il 3’OH di dCMP serve da innesco per la sintesi del DNA complementare REPLICAZIONE DEL DNA DI ADENOVIRUSla sequenza Ori reclutamento della Polimerasi virale e della proteina pre-TP sulla sequenza core il legame di NF-1 e Oct-1 alla sequenza ausiliaria facilita la formazione del complesso - la Polimerasi forma un legame fosfodiesterico tra dCMP e pre-TP

23. l’elica di DNA dislocata forma un “panhandle” via gli “inverted terminal repeats” Replicazione del DNA associazione Pol-pre-TP e …… sintesi del filamento complementare From Flint et al. Principles of Virology (2000), ASM Press

24. I geni intermedi o precoci-ritardati gene IX = proteina IX stabilizzazione del capside virale gene IVa2 = proteina IVa2 transattivazione del promotore dei geni L in associazione con L1 52/55 ed E1A incapsidamento del DNA virale nei capsidi neoformati esone trimeri di pIX

25. proteine strutturali proteine scaffold proteasi IVa 52 kd ESPRESSIONE DEI GENI TARDIVI VA ITR E1A/B E2A/B E4 ITR E3 L1 L2 L3 L4 L5 unico trascritto viene processato per formare circa 18 mRNA con estremità 5’ identiche, divisi nei 5 gruppi L E1A MLTF L1 L2 L3 L4 L5 promotore MLP

26. TRADUZIONE PREFERENZIALE DI mRNA L trasporto facilitato blocco del trasporto di mRNA cellulari al citoplasma accumulo citoplasmatico di mRNA virali E4orf6 (34KDa) E1B 55KDa NES ? RNA binding fattore cellulare

27. Ad virus (shutoff proteins : L ed E proteins) TRADUZIONE PREFERENZIALE nelle fasi tardive dell’infezione blocco della sintesi proteica della cellula ospite m7G eIF4F

28. TRADUZIONE PREFERENZIALE tutti gli mRNA Late contengono una sequenza di 200 nucleotidi al 5’ (tripartite leader) chepermette ilribosome shunting L1 - polipeptidi 52/55 kDa e IIIa L2 - polipeptideIII (base dei pentoni) L3 - polipeptideII (esoni) eproteasi L4 - polipeptide 100 kDa L5- polipeptideIV(fibre)

29. Assemblaggio di adenovirus • proteine singole(no poliproteina) • ruolo critico della proteina L1 • (funzione scaffold ?) • citoplasma • - formazione dei trimeri di proteina II (esoni). Funzione essenziale della proteina L4. nucleo - formazione dei pentameri di proteina III (pentoni) - formazione dei trimeri di proteina IV (fibre) formazione di capsidi vuoti

31. RILASCIO DEL VIRUS disaggregazione del citoscheletro della cellula ospite (L3 proteasi) E3 - death protein (meccanismo sconosciuto)

32. Adenovirus terapeutici

33. TERAPIA GENICA introduzione del gene esogeno nella cellula “malata” espressione della proteina • - correzione del difetto genetico • trasformazione di pro-drug • - blocco del processo tumorale

34. Il DNA si degrada velocemente Sistemi di veicolazione del DNA Per proteggere il DNA è necessario utilizzare dei sistemi di veicolazione Meccanismi non virali liposomi polimeri cationici elettropazione micro-iniezione Meccanismi virali buona protezione del DNA bassa efficienza, nessuna specificità assenza di rischio e di reazioni immunitarie ottima protezione del DNA buona efficienza e specificità possibile rischio di infezione reazioni immunitarie

35. ADENOVIRUS infezioni lievisicurezza (assenza di integrazione e/o oncogenicità)infezione di cellule in divisione e restingfacile manipolazione VETTORI PER TERAPIA GENICA sicurezza alta infettività e selettività espressione sostenuta del gene terapeutico

36. VA Y ITR E1A/B E2B E4 ITR E3 genoma virale L1 L2 L3 L4 L5 vettore navetta transgene Y ITR E1A/B genoma virale VA Y ITR E2B E4 ITR E3 transgene L1 L2 L3 L4 L5 vettore adenovirale VETTORI ADENOVIRALI inserimento del gene terapeutico mediante ricombinazione omologa (quantità massima di DNA trasportato :2-3 kb) ricombinazione

37. lisi VA Y ITR E2B E4 E3 ITR transgene L1 L2 L3 L4 L5 La produzione dei vettori adenovirali avviene in cellule della linea cellulare HEK293) 293 cell E1A E1B nucleo

38. VETTORI ADENOVIRALI Trials iniziali per il trattamento della fibrosi cistica (CF) • - bassa efficienza di transfezione • (le cellule transfettate - distrutte dall’infezione virale) • bassa efficienza di espressione genica • - potente risposta immunitaria • un esito mortale • (danno cerebrale dovuto a reazione infiammatoria scatenata dalle elevate quantità di vettore virale somministrato) Attualmente non sono utilizzati in trials di terapia genica nell’uomo

39. VETTORI ADENOVIRALI però………la sperimentazione continua

40. VETTORI ADENOVIRALI VUOTI o AD ALTA CAPACITA’ loxP Y vettore navetta transgene promoter VA Y E2A/B ITR E4 ITR L5 L1 L2 L3 L4 genoma virale plasmidico ricombinazione in cellule 293 VA Y ITR E4 E2A/B promoter transgene ITR L5 L1 L2 L3 L4 taglio mediato da Cre Y E2B ITR transgene ITR promoter

41. lisi cellulare Y E2B ITR ITR transgene promoter La replicazione dei vettori adenovirali ad alta capacità avviene in presenza di un costrutto “helper” VA E2A/B ITR E4 ITR L1 L2 L3 L4 L5

42. VETTORI ADENOVIRALI AD ALTA CAPACITA’ Vantaggi: infezioni lievisicurezza (assenza di integrazione e/o oncogenicità)infezione di cellule in divisione e restingfacile manipolazione alta capacità (35 kbp)espressione sostenuta del gene terapeutico (circa 80giorni) Limitazioni:contaminazione da helper (in produzioni su larga scala)bassa resascarsa stabilità

43. TERAPIA GENICA CON VETTORI ADENOVIRALI AD ALTA CAPACITA’ Distrofia muscolare (sindrome di Douchen) Fibrosi cistica

44. * non esprime E1B 55K ADENOVIRUS ONCOLITICI ADENOVIRUS Onyx - 015 (dl1520) * VA E4 ITR E3 ITR E1A/B E2A/B L5 genoma Ad L1 L2 L3 L4 • delezione di 827-bp nel gene E1B • e parte della regione E3 (gp19K)

45. ADENOVIRUS dl1520 replica solo in cellule difettive per p53 p53 è inattiva nel 50% dei tumori umani e nel 70% dei tumori della testa e del collo trials clinici in fase III per carcinomi squamosi della testa e del collo (somministrazione del mutante virale nella massa tumorale)