Metode u citogenetici

1. Metode u citogenetici dr. sc. Vesna Boraska

2. Ljudski genom • Genom: skup svih molekula DNA koje čine nasljedni materijal određene vrste organizma • Gen: temeljna jedinica nasljeđivanja koja određuju neko svojstvo • Kromosom: struktura u stanici koja nosi DNA, sastoji se od proteina i DNA molekule

3. Kromosom • svaki kromosom sadrži jednu linearnu dvolančanu DNA čija veličina varira 50-250 milijuna baza • kromosom se sastoji od > 1000 gena, koji su u rangu veličine od nekoliko tisuća pa do 2 milijuna baza • za vrijeme staničnog ciklusa, interfaze, kromosomi su slabije kondenzirani i ne mogu se prepoznati kao zasebna tjelešca • za vrijeme stanične diobe, mitoze, kromosomi podliježu visokom stupnju kondenzacije i tek se tada raspoznaju kao zgusnuta tjelešca unutar st. jezgre

4. Kromosomsko bojenje • kromosomi su maksimalno vidljivi i prepoznatljivi u metafazi st. ciklusa • veliki korak u humanoj citogenetici: tehnike bojenja • karakteristične horizontalne linije na kromosomima 1) identifikaciju svih kromosoma 2) prepoznavanje strukturnih promjena 3) prepoznavanje lomova kromosoma Kromosomska bojanja su omogućila prepoznavanje ogromnog broja kariotipskih aberacija (abnormalnosti) te stvaranje fizičke i genetičke mape kromosoma.

5. Ljudski kariotip • skup svih kromosoma porijeklom iz jedne stanice naziva se kariotip • kariotip humane diploidne (2n) normalne stanice ima 46 kromosoma, a čine ga 22 para autosoma i 2 spolna kromosoma (2X kromosoma za žene ili X i Y kromosomi za muškarce) • poremećaj broja i strukture kromosoma nazivamo kromosomskom aberacijom • svaki poremećaj broja ili ustroja kromosoma uzrokuje teške poremećaje funkcije, koji izazivaju višestruka oštećenja fenotipa

6. X X Y X Kariotip muškarca i žene

7. Kariogram • grafički prikaz kariotipa pri čemu su kromosomi poredani po veličini

8. Standardna citogenetika • za rutinsku analizu kromosoma • metode pruganja omogućuju identifikaciju pojedinih kromosoma na temelju rasporeda svjetlije i tamnije obojenih regija uzduž krakova kromosoma • aberacije koje zahvaćaju manje segmente DNA nije moguće sa sigurnošću otkriti metodama klasične citogenetike pa se koriste molekularne metode

9. Primjena citogenetičkih metoda 1. prenatalno • zbog sumnje na postojanje kromosomskih aberacija zbog obiteljske anamneze ili zbog starosti majke (> 35 godina) → analiza stanica iz plodove vode → analiza pobačenog ploda 2. postnatalno → tumorska citogenetika → citogenetika kod djece s multiplim malformacijama → citogenetika bračnih parova sa sterilitetom

10. G-pruge • najučestalije se koriste u standardnoj citogenetici • ime po Giemsa boji (akridine orange i metilene blu) • kromosomi se tretiraju sa slanom otopinom na 60 °C ili s proteolitičkim enzimom (tripsin) koji uništava proteine, a potom boje Giemsa bojom • tamne prugenas usmjeravaju na postojanje heterokromatinai AT bogati dio kromosoma • svjetlije pruge nas usmjeravaju da bi to mogao biti eukromatini GC bogati dio kromosoma • pomoću pruganja G-metodom moguće je otkriti poremećaje segmenata kromosoma veličine 5Mb

11. Kariotip nakon G-bojenja

12. Q-pruge • 1970. otkrivena DNA-vezujuća fluorokromatska boja quinacrine mustard • quinacrine je planarna molekula koja se interkalira između nukleotidnih baza u DNA • Q-pruge daju istu informaciju kao G-pruge samo što se svjetle Q-pruge prikazuju kao tamne G-pruge i obrnuto • kromosomi pokazuju fluorescentne linije različitog intenziteta, pregled fluorescentnim mikroskopom

13. Q-pruge • obe tehnike (G i Q pruganje) stvaraju otprilike 300 pruga u haploidnom metafaznom genomu te 850-1250 pruga u prometafaznom i profaznom (jer su duži) • najintezivnije se vide satelitne DNA regije izrazito bogate AT pb te duža ruka Y-kromosoma • nema predtretmana – morfologija ostaje očuvana • intezitet boje se može mjeriti

14. Kariotip nakon Q-bojenja

15. C-pruge • kromosomi se najčešće kratko tretiraju s kiselinom, potom s lužinom (barij hidroksid), a na kraju se boje Giemsa bojom • C-pruge boje mjesta oko centromere • jake C-pruge se vide na krom 1, 9, 16 i distalno na Y-kromosomu • različite boje uzrokuju različita, ali i slična obojenja pojedinih kromosoma: Q-bojenjem Y-krom izgleda jednako C-bojenju, ali npr. dijelovi 1, 9, 16 krom nisu svjetli nego tamni

16. Kariotip nakon C-bojenja

17. R-pruge • R-pruge (“reverse”) su otprilike pruge obrnute od G-pruga • tamnije regije su eukromatin, a svijetla područja heterokromatin • kromosomi se tretiraju s vrućom lužinom i potom boje Giemsa ili acridine orange bojom • acridine orange može interkalirati među nukleotidne baze i tada svjetli žuto • dobro za uočavanje strukturalnih promjena na krajevima kromosoma

18. Kariotip nakon R-bojenja

19. Heteromorfizmi • veličina Q i C-pruga varira između ljudi: heteromorfizmi • heteromorfizmi najčešće nastaju prilikom inverzija velikih heterokromatinskih dijelova DNA • konstitutivni heterokromatin ne sadrži gene i ne transkribira se, stoga heteromorfizmi, odnosno varijacije C-pruga, ne utječu na fenotip • heteromorfizmi se koriste kod testiranja očinstva, razlikovanja jednojajčanih od dvojajčanih blizanaca, kod otkrivanja trisomija ili triploidija prilikom određivanja roditelja koji je prenio višak kromosoma • nove preciznije tehnike su više u upotrebi

20. Bojenje u visokoj rezoluciji • profazni i prometafazni kromosomi su puno duži od metafaznih kromosoma • na njima se vidi puno više pruga i zbog toga se najčešće koriste za prepoznavanje malenih strukturalnih promjena • za visoku rezoluciju se stanice dovode u istu fazu: zaustavljanje u S-fazi staničnog ciklusa ametopterinom (metrotreksatom), otpuštanje velikog broja stanica iz S-faze u mediju bogatom timidinom = sinhroniziranje stanica i bojenjem kromosoma u željenoj fazi (npr. prometafazi)

22. Ostale vrste bojenja • postoji još puno fluorokromatskih boja koje se koriste u citološkim bojenjima → neke se vežu specifično za AT pb (DAPI) → neke se vežu specifično GC pb (kromomicin) • postoje i nefluorescentne boje koje se specifično vežu za pojedine baze → metil-zeleno se veže za AT pb → aktinomicin se veže za GC pb

23. kariotip psa • lijevo su DAPI obojeni metafazni kromosomi • desno su inverzni DAPI kromosomi

24. Priprema kariotipa • direktne ili indirektne metode obrade koštane srži, periferne krvi, limfnog čvora i tjelesnih izljeva • potrebno je uzgojiti stanice u kratkotrajnoj kulturi 24-satnoj ili nešto dužoj 48-72 satnoj staničnoj kulturi s primjenom faktora rasta ili mitogena ili bez njih • standardna tehnika pruganja uključuje slijedeće postupke: 1.zaustavljanje dijeljenja stanica u metafazi primjenom kolhicina ili kolcemida 2. razbijanje stanica u hipotoničnoj otopini 3. fiksaciju stanica u metanolu i octenoj kiselini

25. 4. smještanje kromosoma u jednu ravninu “squash” tehnikom (gnječenjem) 5.bojenje kromosoma 6. pregled kromosoma pod svjetlosnim ili fluorescentnim mikroskopom 7. slikanje, izrezivanje kromosoma i izrada kariograma Priprema preparata za vizualizaciju

26. Bojenje antitijelima • imunocitokemijske studije su korištenjem antitijela na adenin i citozin prve pokazale da kromosomske pruge odražavaju razlike u sastavu baza (anti-A i anti-C antitijela) • antitijela se vezuju za baze u jednolančanoj (denaturiranoj) DNA, ali ne u dvolančanoj DNA • razvijen je veliki broj antitijela koji se vezuju za specifična mjesta na DNA molekuli: antitijela na acetilirane histone ili na metilirane baze npr. antitijela na 5-metilcitozin proizvode C-pruge

27. Korištenje restrikcijskih endonukleaza • restrikcijske endonukleaze (RE) cijepaju DNA na točno određenim slijedovima • ako je slijed DNA promijenjen RE ne cijepaju DNA • RE se koriste za cijepanje C-pruga na svojim slijedovima i za analizu heteromorfizama

28. Nazivlje (nomenklatura) strukturnih dijelova na obojenim kromosomima • predložena na konferenciji u Parizu 1971. godine • telomere, centromere i brojne jake pruge se koriste kao mjesta prepoznavanja (oznake) • dijelovi kromosoma između dviju oznaka se nazivaju područjima (regijama) i numerirana su brojevima 1, 2, 3 i 4 na p ("p" za "petit") i q ("q" za "queue") kraku počevši od centromere • pruge su numerirane na isti način • ideogram

29. Nazivlje • bojenje u visokoj rezoluciji je dovelo do dodatnih podjela u ideogramskom prikazu tj. do pojave subpruga • subpruge se označavaju točkom i brojem iza nje • kada su subpruge dodatno podijeljene u još pruga tada se pri imenovanju dodaje još jedan broj • najnovije nazivlje je standardizirano ISCN (International System for Human Cytogenetic Nomenclature) dogovorom 2005. godine

30. Ideogram kromosoma

31. ISCN nomenklatura • t – translokacija: prijenos genetskog materijala s jednog kromosoma na drugi • ins – insercija: jedan dio kromosoma premjestio se na novu poziciju u istom ili nekom drugom kromosomu • inv – inverzija: označava rotaciju dijela kromosoma za 180° • del – delecija: označava gubitak dijela kromosoma • dup – duplikacija: prisutnost dodatne kopije dijela kromosoma

32. ISCN nomenklatura • i – izokromosom: sastoji se od dvaju krakova od kojih je jedan krak zrcalna slika drugog kraka • r – ring kromosom: označava kromosom koji ima izgled prstena • mar – marker kromosom označava bilo koju strukturnu promjenu kromosoma koja se ne može objasniti standardnim terminima • der – derivirani kromosom: strukturna promjena koja uključuje dva ili više kromosoma • (+) plus ili (-) minus označava višak ili manjak pojedinog kromosoma

33. In situ hibridizacija • metoda koja se koristi za identifikaciju specifičnih manjih dijelova kromosoma • npr. ako nam je poznata sekvenca nekog gena (najčešće preko Human Genome projekta), ali ne znamo na kojem je kromosomu lokalizirana, upotrijebit ćemo ovu metodu radi pronalaženja točne lokacije gena • sjedinjuje citogenetičke i molekularne metoda ispitivanja, a temelji se na hibridizaciji komplementarnih sekvenci nukleinskih kiselina • procesom denaturacije ili disocijacije razbijaju se nekovalentne vodikove veze između komplementarnih baza i dolazi do razdvajanja lanaca DNA

34. In situ hibridizacija • denaturacija se može postići povišenjem temperature, dok se njenim snižavanjem obnavljaju vodikove veze, a lanci DNA se ponovo sparuju – renaturacija • korištenjem fluorescentnih DNA ili RNA probi mogu se detektirati određeni DNA slijedovi (npr. geni) na nitroceluloznom filteru (molekularna hibridizacija) ili na citološkim preparatima (in situ hibridizacija) • prisutnost ili odsutnost fluorescentnog signala upotrijebljene DNA probe ukazuje na prisutnost ili odsutnost specifičnih DNA sekvenci u genomu pojedinih stanica

35. In situ hibridizacija ponavljajućih i jedinstvenih DNA slijedova • DNA ili RNA probe mogu biti obilježene radioaktivnim izotopima ili fluorescentnim bojama (FISH) • probe hibridiziraju na denaturirane metafazne kromosome koji su fiksirani na podlogu • pod strogo određenim uvjetima temperature i koncentracije soli događa se sparivanje probe i isključivo njenih komplementarnih slijedova • samo vodikove veze formirane između komplementarnih baza ostaju stabilne • mjesta hibridizacije se određuju autoradiografski (kod radioaktivnih probi) ili prema fluorescenciji

36. Hibridizacija probe

37. Postupak izrade • uzorak suspenzije metafaznih kromosoma se suši na mikroskopskom staklu i tretira s formamidom da kromosomi postanu denaturirani, ali se čuva karakteristična metafazna morfologija • dodavanje i lokalizacija probe koja je hibridizirala sa kromosomalnom DNA

38. Fluorescentna in situ hibridizacija - FISH • DNA probe se u FISH tehnici mogu detektirati na 2 načina: 1. DNA probe se mogu označiti s nekoliko kemijskih skupina (bromodeoksiuracil, digoksigenin, dinitrofenol) koje se potom detektiraju sa specifičnim fluorescirajućim antitijelima 2. fluorescentne skupine mogu biti kovalentno vezane za DNA probu pa nema potrebe za dodavanjem neke druge fluorescentne molekule koja se vezuje za probu • postoje kromosomski specifične fluorescentne boje koje različite kromosome “boje” različitim bojama

41. FISH je moguće izvoditi u interfaznim stanicama stoga je moguće obuhvatiti veći broj stanica te se metoda koristi za ispitivanje i procjenu mozaicizma fluorescentno obilježene probe pokazuju jaku rezoluciju i dobre su za mapiranje gena vrlo osjetljivim digitalnim kamerama i računalnom obradom može se detektirati gotovo svaki signal FISH detektira hibridizaciju na slijedove kratke čak 1 kb može se detektirati jedinstven RNA transkript te odrediti broj RNA transkripata pojedinog gena u stanici u ispitivanju i otkrivanju submikroskopskih poremećaja genoma FISH – rezolucija i primjena

42. Interfazne stanice s translokacijom t(9;22)

43. Kromosomske i lokus specifične probe • mogu se stvarati biblioteke probi – kolekcija probi dobivena kloniranjem fragmenata DNA, ubačena u odgovarajući vektor (plazmid, lambda fag, kozmid) i umnožena u odgovarajućem domaćinu (npr. bakterijama) • 1988. godine su prvi put upotrijebljene biblioteke probi specifičnih za pojedine kromosome • koriste se za otkrivanje strukturalnih i brojčanih kromosomskih promjena • PCR-om (engl. polymerase chain reaction – lančana reakcija polimerazom) se mogu napraviti lokus-specifične probe tj. probe specifične za neki gen, odnosno dio genoma

44. FISH – detekcija kromosoma 18

45. Raznobojni FISH i spektralni kariotip • raznobojni FISH (engl. multicolor FISH) ili M-FISH i spektralni kariotip ili SKY omogućavaju rutinske detekcije svakog kromosoma u metafaznoj ploči • ove dvije metode koriste 24 kromosomske probe i 5 florokromatskih boja • zbog specifičnih kombinacija hibridiziranja probi i njihovog obilježavanja dolazi do različitog obojenja svakog kromosoma • ove metode ne mogu detektirati intrakromosomske promjene (npr. delecije, duplikacije, inverzije), ali su jako dobre za uočavanje promjena u broju kromosoma te za detekciju strukturalnih promjena kao što su translokacije

46. M-FISH

48. Interfazni FISH • razvijene su tehnike kojima se može obojati kromatin u interfaznoj, hipotonično-nabubrenoj jezgri • razdaljine između probi na kromatinskim nitima direktno odgovaraju stvarnim molekularnim razdaljinama – mogu se mjeriti veličine raznih struktura • mnogobrojne probe i raznobojne fluorofore za obilježavanje omogućavaju točniju analizu i precizniju detekciju finih promjena u strukturi kromosoma

49. a i b) histološki prikaz koštane srži – velike atipične limfoidne stanice c i d) kariotipovi dobiveni G-bojenjem e i f) M-FISH kariotipovi g i h)FISH sa specifičnim probama zagene IGH (14q32) i BCL2 (18q23)

50. Hvala na pozornosti!