Kapillaarelektroforees

1. Kapillaarelektroforees Andrei Kante B-31

2. Mis on kapillaarelektroforees? • Elektroforeesi võib defineerida kui laetud osakeste lahutamist elektrivälja mõjul. Elektroforeetiline lahutamine saavutatakse seetõttu, et lahustunud ained liiguvad elektriväljas erineva kiirusega, mis sõltub nende massi ja laengu suhtest ning rakendatavast pingest. • Kui lahusele, mis sisaldab ioone, rakendada pinge, hakkavad ioonid liikuma. Katioonid liiguvad negatiivse elektroodi katoodi suunas ja anioonid positiivse elektroodi anoodi suunas. • Kapillaarelektroforeesil toimub ainete elektroforeetiline lahutamine kapillaarkolonnis

3. Praktiline väärtus • Analüütikas lahutusmeetodina • Keemilises ja biokeemilises analüüsis • Lahendab probleeme, midatraditsiooniliselt lahendas vedelikukromatograafia

4. Ajalugu • Esimese ioonide elektroforeetilise lahutamise torus tegi Tiselius 1934. aastal • 1981. aastalJames Jorgensen kasutas ioonide elektroforeetiliseks lahutamiseks 75 μmläbimõõduga katmata sisepinnaga kvartstoru. • Alates 1987-st aastast laialt levinud

5. Teooria • Kui lahusele, mis sisaldab ioone, rakendada elektripotentsiaali, hakkavad ioonid liikuma. • Erinevad ioonid liiguvad erineva kiirusega. • Niisiis kui on tegemist iooniseguga, siis on sellel segul kalduvus elektroforeetilise liikumise käigus lahutuda erinevate ioonide ribadeks (tsoonideks). Lahutamine on eriti efektiivne peenikeses kapillaartorus.

6. Teooria II • Protsess sõltub iooni liikuvusest ja puhvri elektroosmoosse voo kiirusest, mis omakorda sõltuvad muudest teguritest. Joonis 1. Ioonile mõjuvad jõud

7. Teooria III • Mõlemad jõud võib valemi kujul välja kirjutada järgmiselt: • liikumapanev jõud FLavaldub kujul FL = qE ja takistav jõud FT kujul • F = 6πηv , kusjuures q on iooni laeng, E elektrivälja tugevus, ηpuhvri viskoossus • ja v iooni liikumiskiirus. Tasakaaluolekus on mõlemad jõud võrdsed ja tingimusest FL= FT saab leida, et ioon hakkab liikuma kiirusega • v= q/6πηv*E

8. Teooria IV • Kapillaarelektroforeesi teostatakse kvarts-, klaas- voi teflontorus, mis täidetakse puhvriga (fosfaat-, boraat- voi tsitraatpuhvriga, millel on sobiv pH). • Toru otsad asetatakse puhvriga täidetud anumatesse, millele rakendatakse kõrgepinge 10...30 kV. • Enne analüüsi täidetakse toru üks ots uuritava proovi kitsa tsooniga. • Pingestamise järel hakkavad ioonid migreeruma ja erineva liikuvuse tõttu jaguneb algne tsoon individuaalsetele ioonidele vastavateks ribadeks.

9. Teooria V • Pingestatud kapillaartorus ei hakka liikuma ainult analüüsitavad ioonid, vaid ka puhver. • Liikumine on põhjustatud sellest, et räni pind kvartstorus on kaetud hüdroksüülrühmadega, mis sobiva pH korral deprotoneeruvad, ning kapillaari sisepind omandab negatiivse laengu. • Puhvris olevad prootonid kogunevad difuusse kihina kapillaari sisepinna lähedale.

10. Teooria VI • Pingestamisel hakkavad solvateerunud prootonid liikuma katoodi poole ning tõmbavad kaasa kogu puhvri. • Seega liigub puhver n-ö anoodilt katoodile. Seda nähtust nimetatakse elektroendoosmoosiks (EOF).

11. Teooria VII • Elektroosmoos on enamasti kiirem kui ioonide liikumine ning avaldab seega märkimisväärset mõju kõikidele lahutatavatele ioonidele (osakestele). Joonis 2. Katioonide ja anioonide migratsioon

12. Teooria VIII • Kuna EOF on normaaltingimustes suunatud anoodilt katoodile, siis suurendab see nähtus katioonide liikumiskiirust. • Laenguta osakesed viib EOF lihtsalt kaasa, kuid need ühendid ei lahutu elektroforeesis • Kuna EOF tugevus ületab tavaliselt jõu, mis tõmbab anioone anoodile, siis liiguvad ka anioonid katoodi suunas ehkki väiksema kiirusega, kui on EOF kiirus. Seega on ainete väljumise järjekord selline: kõigepealt väljuvad katioonid, siis neutraalsed ained ja lõpuks anioonid.

13. Elektroosmootne voog (EOF) • Pingestamisel hakkavad lahuses olevad prootonid liikuma katoodi poole ja tõmbavad oma liikumisel kaasa kogu puhvri. Seega voolab puhver nii öelda anoodilt katoodile. • Seda nähtust nimetatakse elektroosmoosiks

14. Aparatuur

15. Aparatuur II • Kõrgepingeallikas väljastab pinget ja voolu kuni 30kV ja 200 µA • Kapillaari otsad on asetatud sisend- ja väljundpuhvrite anumatesse • Detekteeritakse kapillaari siseselt UV detektoritega • Teisi kasutatud detektoreid: amperomeetriline, mass-spektromeetriline, juhtivusdetektor

16. Kapillaarid • Kapillaaridena, kasutatakse polüimiidiga kaetud sulatatud kvartsist torusid,. • Puhvri Joule soojenemine ja soojuse ärajuhtimine kapillaarist • Kapillaari läbiv vool soojendab puhvrit. Tekkiv soojushulk on võrdeline kapillaari ruumalaga (st Qtekkiv~ r3, r - kapillaari raadius) • Tekkiv soojus viiakse ära läbi kapillaari välispinna. Äraviidav soojushulk on võrdeline kapillaari välispindala ja väliskeskkonna temperatuuriga (st Qlahkuv~ r2) • Tasakaal (Qtekkiv =Qlahkuv) saabub kapillaarides, mille siseläbimõõt on 10-100 m ja välisläbimõõt ~ 350 m • Suurema sisediameetriga kapillaare ei saa Joule’i soojusefekti tõttu kasutada (puhver läheb keema!), kuid ka väikeste sisediameetritega kapillaarides tekkivad probleemid analüütide detekteerimisega

17. Meetodi eelised • lihtne protseduur • väga väikesed proovi kogused (nanoliitrites) • analüüside kiirus • hea lahutusvõime • meetod on kvantitatiivne • meetodi eri variatsioonid on rakendatavad alates väikestest ioonidest kuni suurte biomolekulideni ja isegi rakkudeni

18. Tänan!