1 / 10

DNA analüüs kapillaargeelelektroforeesi abil

DNA analüüs kapillaargeelelektroforeesi abil. Kaie Urman B-31. Kapillaarelektroforees.

lilike
Download Presentation

DNA analüüs kapillaargeelelektroforeesi abil

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. DNA analüüs kapillaargeelelektroforeesi abil Kaie Urman B-31

  2. Kapillaarelektroforees • Meetodi üldpõhimõte seisneb väikese, 25-100 μm sisediameetriga kapillaaride kasutamisel, mis täidetakse töölahusega ja nendest lastakse läbi kõrgpinget 10-30 kV. Kapillaarid on võimalikult lühikesed, et analüüsi läbiviimise aeg oleks võimalikult lühike. Tavaliselt kasutatakse 50-75 cm pikkuseid kapillaare. Proovi lisamisel kapillaari hakkavad komponendid eri kiirusega liikuma ja seetõttu on neid võimalik eristada detektoris erinevatel ajahetkedel tekkinud signaalide abil.

  3. Kapillaargeelelektroforees (CGE) • Antud meetodit kasutatakse põhiliselt DNA määramisel ja valkude ning nukleiinhapete eraldamisel, kuna selle meetodi abil on võimalik tuvastada väga väikseid osakesi • Meetod on väga sarnane geelelektroforeesile plaadil, kuid CGE on tunduvalt efektiivsem, kuna geel kipub üle kuumenema, mis võib olla kahjulik proovile. Kapillaarides on energia paremini hajutatud ja proove mõjutatakse seetõttu vähem.

  4. Geelelektroforees • Geelelektroforeesi puhul on oluline, et voolutina kasutatav polümeer oleks tahke, CGE-ga pole see vajalik ning kapillaari sisu võib olla ka vedel. Erinevate proovide eristamistel kasutatakse siiski erinevaid polümeerseid maatrikseid (seotud ja lineaarsed)

  5. EOF halb mõju analüüsile • Kasutades CGE-d on oluline viia EOF tase võimalikult madalale. EOF ehk elektroosmootne voog tähendab, et süsteemi pingestamisel hakkavad prootonid liikuma katoodi poole, liikumisel haaravad ühtlasi kaasa ka puhvri, seega liigub puhver anoodilt katoodile. Kuna aga selline liikumine kapillaaris suruks puhvri välja ja rikuks analüüsi, tuleb kapillaari seinad katta.

  6. DNA analüüs I • Varem kasutati DNA segmenteerimiseks „pluss-miinus” meetodit, siis dideoksü ahela terminatsiooni ja keemiline degradatsiooni. Viimast kasutati rohkem, kuna selle vahendid olid kättesaadavamad. Samas on terminatsioon palju efektiivsem. • Hiljem täiustati meetodit fluorestseeruva aine lisamisega, kus iga aluse puhul oli erinevat tooni fluorestsent, selle abil oli kiiremini ja kergemini võimalik teada saada esinev alus.

  7. DNA analüüs II • Kui võeti kasutusele geelelektroforees, leiti, et meetod on liiga aeglane ning oleks vaja rohkem automatiseeritud meetodit. Selleks võeti kasutusele CGE, mis võimaldab kasutada palju kõrgemaid elektripingeid, protsess muutus peaaegu täielikult automatiseerituks ja kiiremaks. Ainult ühe kapillaari kasutamisest jäi väheseks, selleks koostati kapillaaride jada, mida läbib laserkiir detekteerimiseks.

  8. CGE eelised • Automaatne protsess • Kiire • Lihtne protseduur • Kergesti jälgitav ja korratav • Madalad temperatuurid (valkude puhul oluline)

  9. Tänan kuulamast!

More Related