Animal cell culture 와 유전공학 기법을 이용한 소재의 생산 및 이용

1. 제8, 9장 동물세포공학 Animal cell culture와 유전공학 기법을 이용한 소재의 생산 및 이용 교재259, 제9장 유용단백질의 생산

2. 동물세포 산업화 기술(Animal cell biotechnology)  동물세포 배양 기술을 이용한 생물의약품, 백신, 항체 등의 생산 기술  생물의약품 시장 (2000년) – 166억 달러, 2004년 400억불, 2008년 650억불 예상 * 항체시장(미국 2000년) – 30억 달러

3. 동물세포배양기술의 산업적인 활용 측면 1950년대 : 백신류의 제품생산에 최초로 활용 1970년대 : 질환 치료제 개발분야에 이용 시작 1990년대 : 동물세포 유래의 고부가가치 단백질 제재 생산 치료용 항체 의약품 생산 전망  최근 세포배양기술, 유전자치료기술, 세포치료기술 개발로 산업화 기술로 그 중요성 이 더욱 강조됨 각종 stem cell의 대량배양 유전자 치료 기법의 활성화로 인한 각종 vector의 개발 생산된 물질의 정제 및 product test 기술  동물세포배양체계의 활용성 더욱 증대 –동물세포배양 관련 새로운 의약품 시장이 기하급수적으로 성장

4. 동물 세포배양 (Animal cell culture) 정의 살아있는 동물에서 성장과 분화의 조절을 받는 organized tissue matrix에 존재하는 cell을 sampling 하여 알맞은 영양소와 growth factor를 가지고 있는 배지에서 in vitro상태로 배양시키는 것 동물세포의 특성  동물세포는 미생물에 비해 물리적인 손상을 받기 쉬움(세포벽이 없음) 동물세포는 배양액의 영양소가 복잡하며, 낮은 산소요구량, 높은 밀도의 세포수를 요구  동물세포와 미생물의 당쇄구조 차이로 의약물질을 세포배양으로 생산하기위해서 동물세포를 이용해야 함

5. 표. 동물세포 식물세포 미생물세포의 배양조건의 차이

6. 세포배양의 이용분야 동물세포의 기능 연구 : 환경에 의하여 발생하는 stress에 의한 또는 체내 항상성으로 인한 효과를 배제시킨 상태하의 연구  세포내 활성 연구  세포내 유동성 연구  생태학 연구 –세포와 주위 환경과의 상호관계 규명  세포간 또는 세포와 ECM과의 상호작용 연구  특정 cell에 특정 chemical agent를 첨가했을 때 cell이 나타내는 response 연구  상업적으로 가치가 있는 산물인 biochemicals의 생산 – Vaccine, 단일 클론 항체, 의학용 단백질 생산  Biochemicals : 생체에서 유래된 물질로서 동물이나 사람의 건강유지 및 치료에 적용이 가능한 물질

7. Biopharmaceuticals • Biopharmaceuticals (biologicals) include: • Protein and enzyme therapeutic compounds • Monoclonal antibodies • Subunit vaccines • Revenues $40b in 2003, $65b by 2008 • 600 biologicals currently under development and/or in clinical trials • Potential for follow-on biologicals (biogenerics) • Most either derived from animal tissue or produced in mammalian cell culture systems • Usually Chinese Hamster Ovary (CHO) system

8. Status of Biotech Tobacco Pharmaceutical Production(PMP: Plant-Made Pharmaceuticals) • Measles • Aprotinin (Protease Inhibitor) • α-Galactosidase (Fabry’s Disease) • Interferon α 2a and 2b • Personalized Non-Hodgkin’s Lymphoma Vaccines • Papilloma Virus Vaccines • Lysosomal Acid Lipase (Woman’s Disease; Atherosclerotic Plaques) • Personalized Vaccines for Follicular Lymphoma • α Trichosanthin (HIV) • Diagnostics for Ovarian Cancer • Diagnostics for Ecclampsia • Biomarkers for Alzheimers Disease • Erythropoietein • Human Growth Factor • β-Interferon • Malaria epitopes • Streptococcus Surface Antigen IgA (Dental Caries) • Carcinoembryonic Antigen • Colon Cancer Antigens • Interleukin 10 (Chrohn’s Disease; Inflammatory Bowel Syndrome) • Glucocerebrosidase (Gaucher’s Disease) • Interleukin 4 • Urokinase (Breaks Blood Clots) • Human Serum Albumin • Rabies Antigens • Hepatitis B Surface Antigen • Rotavirus VP6 • Labile Eneterotoxin (Botulism) • Zonna pellucida ZB3 Protein (Contraceptive) • Gastric Lipase (Cystic Fibrosis) • Creatine Kinase • Protein C (Anticoagulant) • Neutropenia (Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor) • Epidermal Growth Factor • α and β Hemoglobin • Angiotensin Converting Enzyme (Hypertension) • Insulin Like Growth Factor (Diabetes) • Tissue Necrosis Factor (Rheumatoid Arthritis) • HIV-1 Peptide • Lactoferrin • Substance P (Neuropeptide) • Animal Pharmaceuticals (Vaccines) • Feline Parvovirus (Panleukopenia) • Canine Parvovirus • Bovine Foot and Mouth

9. High Paying Jobs

10. 세포배양 방법 Monolayer culture versus Suspension culture

11. 세포배양 용어  Chemical defined media  Serum  Antibiotics  Dispersion  Subculture  A primary cell culture vs A secondary culture  Cell line  Established cell line  Transformed animal cell vs normal animal cell  Doubling time  Generation number vs passage number  Confluent – Semiconfluent  Feeder layer  Cloning

12. 세포 배양 용어

13. Growth curve  Lag phase : Cell이 환경에 적응하는 단계 Exponential growth phase : 계속해서 분열하는 단계 Stationary phase : Cell density가 유지되는 단계 Declining phase : Cell density가 감소하는 단계

14. 배양의 scale up  Scale up 이란 laboratory-based process를 상업적으로 발전시키기 위해 culture의 배양 규모를 증가 시키는 것 문제점 : pH의 조절, 온도의 조절, O2 요구량에 따른 공급조절, medium의 mixing. Fig. The scaling-up of culture systems

15. Bioreactor 동물, 식물, 미생물 세포의 large scale culture에 맞게 설계된 배양용기  재질 : 유리, stainless steel, polypropylene 종류  The stirred tank reactor : Bacterial cell culture를 위해 개발 The airlift fermenter : Suspension cell과 hybridoma cell culture에 이용 Monoclonal antibody 생산에 이용 The packed bed bioreactor : Cell이 attach하여 자랄 수 있는 glass bed 같은 정지된 bed particle로 구성 Foot-and-mouth disease vaccine 생산 The fluidized bed reactor : 식물세포배양에서 이용

16. The stirred tank reactor The airlift fermenter The packed bed bioreactor The fluidized bed reactor

17. Animal cell products 표. 동물배양세포에서 생산 가능한 물질의 예

18. 1) Viral vaccine 종류 : 인체용 또는 동물용 백신 – rabies(광견병), polio, A형 간염백신, smallpox, 오제스키병 등  사용된 동물세포: Primary cell line - PMCK, CEF Continuous cell line – MRC-5, Vero, MDCK 생산과정 1. Virus particle의 수가 최대가 될 때까지 증식 2. Culture medium을 농축하고 virus particle을 추출 3. Virus에 inactivating agent를 처리하여 non-pathogenic하게 만들어서 vaccine으로 이용(예: Formaldehyde)

19. 2) 유전자 재조합 기술을 이용한 biologicals의 생산 Bacteria에서는 mammalian protein의 size와 complexity때문에 생산하는데 어려움이 있다. 즉, Bacteria에서는 post-translational modification이 없다.  DNases, 혈액응고인자, FVII, FVIII, FIX, G-CSF, Interferons, Growth factor, FSH, Interleukines 등이 개발됨  유전자 치료용 vector, stem cell을 이용한 세포 치료, 생체 조직공학에 까지 점차 확대 추세에 있음

20. 표. 세포배양에 의한 백신 또는 biologicals 생산 효율 예 Katinger and Bleim(1983)

21. (1) Interferons 정의 : Virus의 증식을 막는 능력을 가진 단백질과 화학적으로 비슷한 분자의 집합이다. 인터페론은 바이러스에 감염된 세포가 만들어내는 항바이러스 작용을 갖는 단백질로서 1950년대 말에 발견되었다. 종류 : α, β, γ  생산 : Interferon-α는 Namalwa세포를 이용하여 8,000 liter의 bioreactor에서 세포배양기술에의해 산업적으로 생산

22. (2) Antibodies 최근에 동물세포배양체계활용은 항체제제의 개발과 밀접하게 관련되어 있으며, 세계 생물의약품 시장의 매출 급신장에도 항체제제가 크게 기여하고 있다. 항체제제  최초의 인간화 항체제제로서는 1977년 Hoffmann-La Roche사에 의해 개발된 Zenapax: Anti-interleukin 2 수용체 항체로서 면역억제제로 인가됨 ReoPro : 혈소판 응집 저해용 키메라 항체제제 (Centocor사)  Rituxan : 암 치료용 항체제제(Genentech사와 IDEC사)  Herceptin : 유방암 치료제인 항상피세포 성장인자 수용체(HER2))의 인간화 항체 Remicade : 항 TNF 인간화 항체제제  시장 규모 : 미국 내 시장 규모는 2000년 기준으로 약 30억 달러, 이는 전체 생물의약 시장 166억 달러의 20%정도의 막대한 시장이다.

23.  Monoclonal antibody (단클론 항체)  Hybridoma를 세포배양하여 생산  동물세포 배양에서 생산되는 가장 대표적인 단백질중의 하나  분석도구, 진단약, 치료제로서 사용 Airlift fermenter는 Hybridoma cell의 세포배양과 monoclonal antibodies의 생산을 위하여 만들어짐

24. (3) Hormone (예 : EPO)  Human erythropoietin(EPO)은 신장에서 생산되는 당단백질 호르몬 – Amgen사 상품화시킴  특징 : EPO는 분자량 34kDa으로 60%가 당쇄로 차지하고 있고, 당쇄말단에 결합하고 있는 sialic acid가 이 물질의 활성에 중요한 역할. 기능 : 적혈구 세포인 erythrocyte의 생성을 촉진하며, 혈액과 관련된 질병의 치료제 - 만성신부전증  재조합기술에 의해 EPO을 생산하기 위해서 당쇄수식이 가능한 동물세포를 이용해야 함 - CHO, BHK, Namalwa 세포 이용. 현재 시판중인 EPO는 동물세포배양에서 생산된 것으로 1g 당 84만 $ EPO의 세계 시장 규모는 약 28억 $

25. 배양액의 개선 동물세포배양은 비교적 복잡한 영양소 요구  기본적인 영양소인 탄수화물 공급원, 비타민, 무기질류, 아미노산과 혈청, 항생물질 등. 혈청의 성분 : 아직도 정확하게 알려져 있지 않으나, 아미노산, 성장인자, 호르몬, 지방, 단백질, 미네랄 등 함유  혈청의 단점  가격이 비싸다. 혈청내 존재하는 단백질과 펩타이드는 생산물질을 분리, 정제하는 공정을 더욱 복잡하게 한다. 병원균의 오염 가능성 존재 –여과 멸균과정 필요  혈청성분이 동일하지 않음  따라서 최근에는 혈청대신에 insulin, bovine serum albumin 등의 혼합물의 첨가로 대체하려는 시도를 하고 있다. – Serum free media (무혈청 배지) 무혈청 배지는 배지 가격을 낮출 수 있고 생산물의 분리, 정제공정의 단순화, 병원균의 오염기회를 줄여 결과의 재현성을 향상시킬 수 있다. 비쌈

26. 교재 217, 제8장 동물세포공학 유전자 조작된 포유동물 세포로부터의 소재 생산 유전공학의 발달로 동물세포내 유전자 도입은 가능하게 되었지만, 아직까지 여러가지 문제점이 있다. 첫째 : 세포내 도입된 유전자가 숙주세포의 genome에 삽입되는 비율이 낮다  둘째 : 숙주 세포의 genome에 삽입되었더라도 발현효율이 낮다. 이러한 유전자 도입의 문제점을 해결하기 위하여 최근 여러 가지 새로운 방법들이 개발, 이용되고 있다. 동물의 세포 또는 수정란내에 재조합유전자를 도입, 발현 시키기 위해서는 유전자 발현에 영향을 미치는 여러가지 유전정보가 vector내에 포함되어야 한다. 유전자의 효율적 전사, 번역을 위한 조건 : Promoter, 증폭부위요소 인트론, 아데닌중합신호 등

28. 유전자 도입 벡터 동물세포에 유전자를 도입하기 위해서는 바이러스 벡터를 많이 이용  바이러스 벡터의 장점  첫째 : 바이러스 표면단백질이 숙주세포의 receptor와 결합하여 바이러스 genome을 효율적으로 숙주세포내로 도입할 수 있다. 둘째 : 바이러스 genome이 숙주세포내에서 복제시 외래유전자도 복제되어 높은 수준으로 발현이 가능하다. 유전자 도입 벡터(Gene transfer vector)로 이용되기 위한 조건 Cloning site,  Origin of replication(복제 기점)  Packaging

29. Gene x or reporter gene DNA transfection in mammalian cells. P - Calcium phosphate precipitation - Lipofectamine (lipid complex) - Physical breakage / DNA gun - Microinjection - Viral vectors Adenovirus Retrovirus AAV Herpes simplex Lentivirus Tissue culture Transgenic animals

30. 핵산의 크기가 커서 Packgaing이 안될 경우  핵산 크기가 클 경우 packaging되지 않으므로 바이러스 제놈의 일부를 제거하여 외래유전자를 삽입시키기 위해 바이러스 genome의 일부를 제거한다. 결손 바이러스(Defective virus) : 바이러스 genome의 일부가 제거되어 동물세포를 감염시키지 못하는 바이러스  도움 바이러스(Helper virus) : 결손 바이러스를 증폭시키는데 필요한 단백질을 만드는 바이러스, 이 것도 다른 유전자가 결손 되어 자기 혼자서는 증폭되지 않는다. - 결손 바이러스와 도움 바이러스를 함께 감염시켜 바이러스를 증폭하고 target gene을 증폭 발현시킴

31. Transient expression system(잠정 발현 시스템)  DNA를 세포에 도입 후 24-48시간 이내에 도입 유전자의 발현을 검정  프로모터의 효율분석등에 많이 이용 DNA가 숙주세포의 genome에 거의 삽입되지 않음 Stable expression system(안정 발현 시스템) Genome에 유전자가 삽입된 세포만을 선발하여 이용  유전자 삽입 효율은 낮으나 DNA가 삽입된 세포만 선발하여 배양하여 분열시키면 삽입된 유전자를 함유한 많은 양의 세포를 얻을 수 있다.

32. Solenoid attaches to scaffold, generating loops Packing ratio ~ 25 for this step = 1000 overall

33. 1) SV40 바이러스 벡터  특징 : 원숭이 세포는 감염 시키나 설치류나 사람의 세포는 감염 못시킴 Genome의 구성 : early region, late region 방법 1. 도움 바이러스와 말기영역부위를 외래유전자로 대체한 결손 바이러스를 만듬 2. 이들을 transfection 시킴 3. 재조합 바이러스 회수 4. 다른 동물세포에 감염, 외래유전자 발현  단점 다양한 종의 세포에 이용하기 어려움  외래유전자의 크기가 2.5kb로 제한  동물세포에 SV40 genome이 도입되는 과정 에서 유전자 결실이나 재배치가 될 가능성이 있음 SV40을 이용하여 외래 유전자 도입

34. 2) Vaccinia 바이러스 벡터  특징 : Genome의 크기가 185kb로 매우 크기 때문에 외래 유전자 삽입 어렵다. 따라서  박테리오파아지 T7 RNA polymerase를 발현하는 vaccinia 바이러스 genome이 삽입되어 있는 세포를 이용  방법 1. T7 RNA polymerase 유전자와vaccinia virus promoter를 갖는 vaccinia virus를 세포에 감염시킨다. 2. Target gene과 Bacteriophage T7 RNA polymerase promoter를 연결한 재조합 유전자를 세포에 주입 3. Vaccinia genome에 의해 발현된 T7 RNA polymerase는 promoter를 인식하여 외래유전자를 높은 수준으로 발현 Vaccinia 바이러스 벡터를 이용한 동물세포내 유전자 도입

35. 3) Retrovirus vector 특징  레트로바이러스는 숙주세포에 해가 적음 숙주세포의 genome에 안정하게 도입  대부분의 세포를 감염시킬 수 있음 RNA virus  Long terminal region promoter에 의해 외래유전자 발현  방법 1. Retrovirus vector를 packaging cell에 도입 2. 재조합 vector RNA만 packaging됨 3. Virus 분리 4. 세포에 infection 5. 삽입된 외래 유전자는 강력한 LTR promoter에 의하여 발현됨 Retrovirus vector를 이용한 동물세포내 외래유전자의 도입

36. 유전자 도입 방법 (transformation methods) 1) 인산 칼슘 침전 방법  가장 많이 이용되는 방법  방법 1. DNA-CaPO4침전물을 형성 2. 침전물을 세포의 배양액에 첨가 3. DNA가 세포에 도입(세포가 Ca를 흡수하는 한 방법인 Endocytosis 을응용) 숙주세포의 genome 에 도입되는 효율 2-5%  Plasmid와 같은 Circular DNA가 linear DNA 보다 100배 높은 효율을 가짐 Calcium phosphate precipitation

37. 2) DEAE-dextran 방법  잠정발현시스템으로 높은 유전자 발현을 원하는 경우 이용 DEAE-dextran(+)와 DNA의 인산화 골격(-)의 복합체 Endocytosis 에 의해 세포질로 유입  단점 : Stable expression system에는 효과적이지 않다. 방법 1. Transfection 하루 전에 cell을 plate 한다. 2. DEAE-dextran란을 37℃에 보관 3. 배지를 제거후 2번 wash 4. DNA-DEAE-dextran을 cell에 첨가 5. 37℃에 30min 동안 incubation 6. 성장배지 첨가후 48-72hrs 동안 incubation DEAE-dextran transfection 방법

38. 3) 미세주입 방법  현미경하에서 DNA용액을 미세피펫으로 세포의 핵에 직접 도입하는 방법  장점 : 수정란에 주입하는데 이용  단점 : 미세주입 시스템 장비 구입과 전문기술 요구 Microinjection 모식도

39. 4) Protoplast 융합 Protoplast : bacteria를 lysozyme 처리시 세포막이 제거된 상태  방법 1. 재조합 DNA를 가진 protoplast + 동물세포 2. PEG(polyethylene glycol)처리 3. 두 세포의 융합 4. 재조합 DNA가 숙주세포로 도입  장점 : Plasmid DNA를 분리할 필요가 없다. 단점 : Bacteria chromosome도 도입될 수 있다. Protoplast fusion

40. 5) Electroporation 방법  특징 : Lympocyte와 같이 Suspension 한 상태에서 자라는 세포에서 많이 이용  원리 : 세포막에 high-volt electric impulse(2-4kV)를 주면 세포막에 잠정적으로 micropore가 생겨 DNA를 세포질로 도입 Electroporation을 이용한 동물세포내 유전자 도입

42. 6) Liposome encapsulation 방법  원리 : DNA를 liposome vesicle에 encapsulation시키고 PEG 를 이용하여 liposome과 세포를 융합시켜 세포내로 도입하는 방법 Liopsome을 이용한 동물세포내 유전자 도입

43. 도입된 유전자의 발현 검정 도입된 유전자가 발현되는 지는 mRNA나 Protein을 분석하여 검증할 수 있다 mRNA : Northern analysis  Protein : Western analysis 발현물이 효소인 경우 –효소의 역가를 측정하여 검증  그러나 도입된 유전자와 같은 유전자가 숙주세포의 genome에 존재할 때 분석이 불가능  해결책  표지 유전자(reporter gene)와 원하는 유전자(target gene)를 연결한 복합 유전자(hybrid gene)을 도입하여 삽입여부 확인 CAT assay – Transient transfection HAT selection system – Stable transfection TPA selection system – Stable transfection

44. Chloramphenicol acetyl • transferase(CAT) assay – • Transient transfection • (Promoter 효과 연구) • CAT 효소 : Chlorampenicol을 • acetylation 시키는 효소 •  방법 • Promoter + CAT gene을 인산칼슘 침전법으로 eukaryotic cell에 집어넣는다. • 3일간 배양 • Cell extract + 14C Chloramphenicol배양 • TLC로 분리 • Promoter의 효과 측정

45. HAT selection system - stabe transfection 방법 GPT(Xanthine – guanine phosphoribosyl transferase) 유전자가 없는 eukaryotic cell에 옆의 recombinant DNA를 인산칼슘침전방법으로 집어 넣는다 3일간 배양 HAT 배지에서 배양 – GPT 함유 세포 선발됨

46. TPA selection system • 방법 • TPA (tissue plasminogen) • 이 함유된 옆의 recombinant • DNA를 eukaryotic cell에 • transfection 시킴 • (2) Casein – agar mixture에서 • 자라게함 • (3) 세포주위에 plaqu 생김

47. 유전자 전이 동물을 이용한 동물소재의 생산 유전자 전이동물 (transgenic animal) 이란?  재조합 된 외래 유전자를 생식세포(Germ cell)에 가지고 있어 후속세대에 계속 유전되는 동물  생산방법 :  Microinjection –가장 일반적임, 생산효율 저조(0.5-1.0%), 유전자 발현이 비교적 높고 안정 Retrovirus 감염 Embryonic stem cell  Chimera 정자에 의한 유전자 전이

48. 유전자 전이동물의 연구 현황  유전자 전이 동물은 내재하는 유전자를 인위적으로 변형, 불활성화, 및 새로운 유전자 삽입 등의 방법으로 생산  응용 분야  기초과학 : 유전자의 구조와 기능에 관한 연구, 세포의 근원과 발생에 관한 연구  농업 : 동물의 성장과 대사, 육질의 향상, 우유의 성분 조절, 새로운 기능을 가진 동물생산 내병성이 강한 동물의 생산, 인체의약품 생산  의학 : 암의 발생과정과 oncogene에 대한 연구, 질병의 치료에 이용되는 호르몬 또는 효소 연구 혈액성분을 동물 유선을 이용하여 생산하는 연구 인간의 질병에 유사한 동물을 생산 하여 치료 방법을 연구 개발  새로운 분야 적용 : 항체를 유전자 전이동물에 발현

49. 형질전환 동물 개발하는 방법 비교 (DNA 미세주입법 vs 체세포 복제) DNA 미세주입법  외래 유전자의 게놈내 삽입 빈도가 가축의 경우 1% 미만  생산된 젖소는 대부분 mosaic –외래 유전자가 자손에게 전달되지 않음  막대한 연구비와 오랜 연구기간 체세포 복제  외래 유전자가 도입된 세포만을 핵치환 하기 때문에 mosaic없는 100% 형질전환 수정란이나 동물을 생산  체세포 성을 미리 판별하여 암컷 형질전환젖소만을 개발 –유용단백질 대량생산  연구기간 단축, 산업화 조기 달성

50. 유선을 생물반응기(animal bioreator)로 이용한 동물소재의 생산