Die DNA-Replikation erfolgt bi-direktional

1. Die DNA-Replikation erfolgt bi-direktional Replikationsgabel DNA-Polymerasen starten die Replikation am Replikations-Startpunkt = “Origin“

2. Startkomplex - Primase - DNA-Polymerase Replikation Wie funktioniert der einzige “Origin of Replication“ in E. coli? OriC DnaA (ATPase) 30°C DnaB = Helikase DnaC ATP Erkennung Offener Komplex leichtes „Schmelzen“ der DNA „Prä-Priming“ Komplex

3. Brechen der H-Brücken ( Helicase) entlang der Basenpaare Der Mechanismus der DNA-Replikation ori

4. 5‘ allgemein gilt: Desoxynukleosid-5‘-Triphosphate sind die aktivierten Vorstufen bei der DNA-Synthese: dATP, dCTP, dGTP, dTTP (dNMP) n + dNTP (dNTP) n+1+ PPi DNA-Polymerase Neu-eintretendes Desoxy-Nukleosid-Triphosphat 3‘ Nukleophiler Angriff der 3‘-OH Gruppe am a-Phosphoatom 5‘ 0 + 0 0 O 3‘ Die Biochemie der DNA-Kettenverlängerung Wie werden die Desoxy-Nukleotid-Bausteine in die DNA eingebaut? o 5‘ > 3‘ Verknüpfung (Phospho-Diester-Brücken) o 5‘-Ende mit Phosphat-Gruppe o 3‘-Ende mit freier OH-Gruppe

5. Die Biochemie der DNA-Kettenverlängerung Wie werden die Desoxy-Nukleotid-Bausteine in die DNA eingebaut?

6. 5‘ DNA-Polymerase 3‘ Bewegung der Replikationsgabel 5‘ 3‘ DNA-Polymerase Die Biochemie der DNA-Replikation (dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1+ PPi DNA-Polymerase grundsätzlich gilt, daß DNA-Polymerasen nur synthetisieren können 5‘>3‘ d. h . DNA-Polymerasen besitzen eine 5‘>3‘ Polymerase-Aktivität 3‘ 5‘

7. Das Problem der “lagging strand“ DNA-Replikation DNA-Polymerasen besitzen eine 5‘>3‘ Polymerase-Aktivität DNA-Polymerase kontinuierlicher Strang (“leading strand“) 3‘ Bewegung der Replikationsgabel 3‘ 3‘ 5‘ 5‘ 5‘ 3‘ dis-kontinuierlicher Strang (“lagging strand“) 5‘

8. Noch ein anderes Problem bei der DNA-Replikation......

9. DNA-Polymerasen benötigen einen kurzen “RNA-Primer“ zum Start der Replikation DNA-Polymerasen verwenden den einzelsträngigne DNA-Strang als Matritze, aber der Einzelstrang muß einen Primer gebunden haben (doppelsträngiger Abschnitt), damit die DNA-Polymerase den 2. Strang auffüllen kann Primer DNA-Polymerase

10. DNA-Polymerase 3‘ 5‘ Primer 3‘ 5‘ DNA-Polymerasen benötigen einen kurzen “RNA-Primer“ zum Start der Replikation 3‘ leading strand 3‘ 5‘ lagging strand 5‘

11. Die vollständige Synthese des Folgestrangs Primer Primer Okazaki Fragment

12. Die Ligase-Reaktion DNA-Ligase + ATP + PPi

13. ATP PPi Enzym-AMP Die einzelnen Schritte der Ligase-Reaktion e-Aminogruppe eines Lysins AMP

14. Vergleich der drei DNA-Polymerasen von E. coli DNA-Reparatur DNA-Reparatur DNA-Replikation Anzahl der Untereinheiten Synthese-Rate (Nukleotide/sec) Prozessivität (eingefügte Nukleotide vor dem Abdissoziieren) 3‘>5‘ Exonuclease (Korrekturlesen) ja ja ja 5‘>3‘ Exonuclease ja nein nein Molekulargewicht 103 kDa 88 kDa 900 kDa

15. DNA-Polymerase III vermutlich Schleifenbildung b-Untereinheit für die Bindung an die DNA a-Untereinheit mit DNA-Polymerase- Aktivität (5‘>3‘) e-Untereinheit 3‘>5‘ Exonuclease Untereinheiten und Struktur der DNA-Polymerase III von E. coli Die DNA-Polymerase III (Holoenzym) bildet einen Dimer und kann dadurch gleichzeitig sowohl am Leitstrang wie am Folgestrang synthetisieren. Die Synthesegeschwindigkeit beträgt: V = 1000 BP/sec

16. Kristallstruktur von Klammer-Dimer Komplex Klammer Griff DNA DNA-Polymerase III Der Griff-Klammer-Komplex (RFC-PCNA) kann armreifartig an der DNA entlanggleiten. An den Griff-Klammer-Komplex bindet die DNA-Polymerase III, die während der Replikation dadurch mit hoher Prozessivität an der DNA entlangwandern kann, ohne dabei abzufallen „Akzessorische Proteine“ der DNA-Polymerase

17. Primosom Primase Pol III Okazaki- Stücke (DNA-Polymerase) Das E. coli Replisom mit seinen verschiedenen Komponenten Damit die DNA-Replikation in der Replikationsgabel kontinuierlich voran- schreiten kann, muß die doppelsträngigeDNA in der Gabel in die Einzelstränge getrennt werden. >> Eine DNA-Helicase windet unter ATP-Verbrauch die DNA auf. Bewegungsrichtung der Replikationsgabel Helicase Damit die entwundene DNA kurzzeitig einzelsträngig bleibt, bindet das SSB (“single-stranded DNA-binding protein“) an die noch nicht replizierte DNA. Damit wird die Verknäuelung der ss-DNA verhindert. SSB Später wird das SSB von der vorrückenden DNA-Polymerase wieder von der Matritze abgetrennt. 5‘ 3‘ 3‘ RNA-Primer DNA-Polymerase I + Ligase Leitstrang Folgestrang

18. jedoch: ein- und dieselbe DNA-Polymerase III synthetisiert gleichzeitig Leit- und Folgestrang! Eine konzertierte Aktion bei der Synthese von Leit- und Folgestrang

19. Bewegungsrichtung der Replikationsgabel Primer Okazaki- Stück „Schleifenbildung“ am Folgestrang bei der DNA-Replikation Helicase Primosom Schleifenbildung DNA-Polymerase III Holoenzym-Dimer Primer DNA-Polymerase III Holoenzym-Dimer Leitstrang Folgestrang

20. Helicase Primosom Schleifenbildung 3‘ 3‘ 5‘ Primer 5‘ DNA-Polymerase III Holoenzym-Dimer 5‘ 3‘ Schleifenbildung bei der Synthese von Leit- und Folgestrang Okazaki- Stück DNA-Polymerase III Holonenzym-Dimer

21. DNA-Polymerase III Holonenzym-Dimer Die Schleifenbildungan der DNA-Folgestrangmatritze ermöglicht der dimeren DNA-Polymerase III die Synthese beider Tochterstränge in der Replikationsgabel. Dadurch wird die physikalische Richtung am Folgestrang, nicht aber die biochemische Richtung(5´>3´) umgedreht

22. Eine konzertierte Aktion bei der Synthese von Leit- und Folgestrang Leitstrang Griff Bewegungsrichtung der Replikationsgabel Klammer DNA-Polymerase III Helicase Primase Topoisomerase Ligase RNA-Primer DNA-Polymerase I SSB Okazaki- Stücke RNA-Primer Folgestrang

23. Die gleichzeitige Synthese von DNA Leit- und Folgestrang durch die dimere DNA-Polymerase III

24. Eine Computer-Animation: gleichzeitige Synthese von DNA Leit- und Folgestrang durch das Holo-Enzym DNA-Polymerase III

25. Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung • 53 • Essentielle Grundlage des Lebens ist die Fähigkeit der identischen Reduplikation • des genetischen Materials und damit letztendlich der Vererbung einer funktionsfähigen • Zellstruktur. • Welche Aussage zur Replikation der DNA trifft zu? • (A) Beim Start der Replikation werden RNA-Primer synthetisiert. • (B) Die Neusynthese der DNA erfolgt an beiden Strängen einer • Replikationsgabel in kürzeren Stücken, so genannten Okazaki-Fragmenten. • (C) Für die Verknüpfung der DNA-Fragmente nach Entfernen der Primer • phosphoryliert die DNA-Ligase das 3’-OH-Ende eines Fragmentes. • (D) Helicasen schützen intermedär gebildete einzelsträngige DNA-Bereiche • vor Schädigungen und Strangbrüchen. • (E) Interkalatoren, die als Zytostatika in der Tumortherapie eingesetzt werden, • binden spezifisch die DNA-Polymerasen.

26. Die Entwindung des DNA-Matritzenstrangs während der DNA-Replikation führt zu Verdrillungen

27. Entwinden der DNA während der Replikation durch die Helicase dadurch Verdrillung der DNA Replikation Transienter Bruch des einen Strangs erlaubt freie Rotation der DNA-Stränge und Entdrillung der beiden Stränge >>katalysiert durchDNA-Topoisomerase

28. Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung

29. Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung

30. Nukleosomen-Assemblierung nach DNA-Replikation in Eukaryonten

31. Die Enden der menschlichen Chromosomen sind linear >>> Probleme bei der Replikation Telomerase mit RNA Primer