Tema 19. Estrategias de control de actividad enzimática

1. Tema 19. Estrategias de control de actividad enzimática 1. Regulación de la cantidad de enzima 2.1. Enzimas constitutivas y enzimas inducibles 2.2. Estudio cinético del recambio enzimatico 2. Regulación de la actividad enzimática: 2.1.Modificaciones covalentes 2.1.1. Modificaciones covalentes irreversibles 2.1.2. Modificaciones covalentes reversibles

2. Introducción * En este tema consideraremos otra de las características peculiares de las enzimas: la capacidad de regular su actividad, es decir, la propiedad de regulación de la actividad enzimática según convenga, especialmente “in vivo”. 1) Regulando la cantidad de enzima 2) Regulando la actividad de las enzimas presentes

3. 1. Regulando la cantidad de enzima. Velocidad o la actividad es función de la cantidad Cantidad Balance de síntesis y degradación Vida media Ornitina descarboxilasa 15-20 minutos Lactato deshidrogenasa 150 horas Este procedimiento se conoce como: Regulación a largo plazo Gran gasto energético 3 ATP por aminoácido • Ventajas: • Adaptación cambios en el metabolismo celular debido a señales químicas (hormonas, segundos mensajeros, nutrientes, etc), físicas (energía radiante, temperatura). • 2. Supresión de proteínas mutadas (mamiferos superiores, el número diario de errores o mutaciones en la síntesis de proteínas del orden del millón).

4. 1.1. Enzimas constitutivas y enzimas inducibles Desde el punto de vista de adaptación, se pueden considerar dos tipos de enzimas Enzimas constitutivas (house keeping enzymes) Mismo nivel Procesos de síntesis y degradación ajustados y compensados Cantidad de proteína y mRNA permanecen inalterados No suelen presidir pasos reguladores de vías metabólicas Enzimas inducibles Niveles según las diferentes circunstancias metabólicas Inducción de la cantidad debido a estimulos Enzimas controladoras de vías metabólicas Estímulo : Variar la velocidad de síntesis (inducción o represión síntesis proteica) Variar el proceso de degradación Cambio cantidad total de la proteína enzimática Estudiar la cinética de recambio Actividad

5. 1.2. Estudio cinético del recambio enzimático Procesos de síntesis siguen cinética de orden 0 (independiente de la cantidad de enzima) ks constante fenomenológica del proceso total de síntesis (M t-1) Procesos de degradación siguen cinética de orden 1 (depende de la cantidad de enzima) kD constante de degradación (t-1) Estado estacionario elemental Nuevo estado estacionario Cambios en las constantes ESTIMULO

6. Separando variables Integrando la ecuación entre [Eo] y [Et] y entre 0 y t [Eo] enzima antes del estímulo [Et] enzima después del estímulo en el nuevo estado estacionario al cabo del tiempo t Resolución de la integral, aplicando los límites de integración Después del estímulo la Ks tiende a cero y la ecuación queda como Vida media de una proteína La vida media es función de la constante de degradación

7. Proteínas enzimáticas que responden rápidamente a un estímulo externo son proteínas fácilmente degradadas Ornitina descarboxilasa 0,3-0,5 horas Actividad enzimática Triptofano dioxigenasa 2,5 horas Piruvato quinasa 84 horas 5 Tiempo (horas) Cambio en las actividades enzimáticas inducidas por un estímulo . A la 5 horas cesa el estímulo y comienza la degradación. Cuanto menor es el tiempo de vida media el nuevo estado estacionaro se alcanza más rapidamente.

8. Medida experimental de la velocidad de síntesis Incorporación de aminoacidos marcados Separación selectiva de la proteína (Inmunoprecipitación selectiva)

9. 2. Regulando la actividad de las enzimas: Regulación a corto plazo. * Este sistema de regulación permite dar respuestas mucho más rápidas, prácticamente inmediatas, a los cambios experimentados por la célula, y básicamente responde a algunos de los siguientes mecanismos: - Mecanismos varios:  inhibidores/activadores, variaciones de: pH, temperatura, ..., disponibilidad de cofactores, reacciones catalíticas no-enzimáticas, etc.

10. - Mecanismos que implican cambios covalentes: Regulación pormodificación covalente. * Entre las modificaciones covalentes cabe distinguir dos grandes grupos: * Irreversible Frecuencia BAJAExtracelular * Reversible Frecuencia ALTAIntracelular - Mecanismos que implican cambios conformacionales: Regulación alostérica. Tema siguiente

11. 2.1 MODIFICACIÓN COVALENTE 2.1.1. Modificación Covalente Irreversible. - Dentro del grupo de las modificaciones covalentes irreversibles, destaca por su importancia, las modificaciones por Proteolisis Parcial.

12. En la siguiente Tabla se muestran algunas enzimas que se activan por proteolisis parcial ENZIMA PRECURSOR - Tripsina Tripsinógeno Secreción pancreática - Quimotripsina Quimotripsinógeno Secreción pancreática - Elastasa Proelastasa Secreción pancreática - Carboxipeptidasa Procarboxipeptidasa Secreción pancreática - Fosfolipasa A2* Fosfolipasa A2Secreción pancreática - Pepsina Pepsinógeno Secreción gástrica (jugo gástrico), actividad óptima pH 1-5 -Trombina Protrombina Parte del sistema de coagulación sangíneo - Clr Clr Parte del primer componente del sistema del complemento - Quitina sintasa** Zimógeno Implicada en la formación del septum durante la división cellular en las levaduras -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------* Dijkstra et al (1981) Nature 289, 604 ** Cabib (1976) Trends Biochem Sci. 1, 275

13. Veamos este tipo de regulación para el caso particular de las proteasas pancreáticas: • - tripsina, - quimotripsina, • - elastasa y • - carboxipeptidasa. * Todas ellas se sintetizan en el páncreas, y se segregan a través del conducto pancreático al duodeno del intestino delgado, en respuesta a una señal hormonal generada cuando el alimento sale del estómago. * Sin embargo, estas proteasas no se sintetizan en su forma activa. Sino que se sintetizan en forma de moléculas ligeramente más grandes, catalíticamente inactivas, denominadas zimógenos o proproteasas: tripsinógeno, quimotripsinógeno, proelastasa y procarboxipeptidasa.

14. * Los zimógenos tras un proceso de proteolisis parcial, en el duodeno, se transforman en las correspondientes enzimas activas. Estas enzimas tras cumplir sus fines, se degradan completamente, por lo que no ponen en peligro el tejido intestinal.

16. * La transformación de los zimógenos o proproteasas en proteasas activas la podemos representar esquemáticamente de la siguiente manera: Tripsinógeno Enteropeptidasa Tripsina

17. * El primer paso es la activación de la tripsina en el duodeno. * Se elimina un hexapéptido del extremo N-terminal del tripsinógeno gracias a la enteropeptidasa, proteasa secretada por las células duodenales.

18. * Esta acción produce la tripsina activa, que a su vez activa los demás zimógenos y proenzimas, mediante rupturas proteolíticas específicas. * La tripsina una vez formada actúa de manera autocatalítica, activando más moléculas de tripsinógeno, además de activar los demás zimógenos y proenzimas. * La activación del quimotripsinógeno a quimotripsina es uno de los ejemplos más complejos y mejor estudiados de la activación por proteolisis parcial.

20. * En el primer paso la tripsina rompe el enlace entre la Arg15 y la Ile16. El péptido N-terminal continua unido al resto de la molécula a través de un punte -S-S- entre los residuos 1 y 122. El producto resultante se denomina p-quimotripsina, que ya es una forma activa. * La p-quimotripsina no es aun la forma “terminada” o final de la quimotripsina (a-quimotripsina), para ello es necesario que se produzcan una serie de rupturas autocatalíticas, catalizadas por la p-quimotripsina: - Eliminación de los residuos 14 y 15, y cortando entre el 145 y 146.

22. * De esta manera se forma la a-quimotripsina, que es la forma activa de la enzima que se encuentra en el tracto digestivo. * Esta batería de enzimas: tripsina, quimotripsina, elastasa y carboxipeptidasa, junto con la pepsina del estómago, y otras proteasas secretadas por las células de la pared intestinal, es capaz de digerir finalmente la mayor parte de las proteínas ingeridas en la dieta a aminoácidos libres, dipéptidos y tripéptidos, que son absorbidos por el epitelio intestinal.

23. NOTA: * Incluso los zimógenos inactivos son una posible fuente de peligro para el páncreas. * Dado que la activación de la tripsina puede ser autocatalítica, la presencia de una sola molécula activa de tripsina podría poner en marcha toda la cadena de manera prematura. * En consecuencia el páncreas se protege a sí mismo mediante la síntesis de una proteína denominada Inhibidor de la Tripsina Pancreática Secretora (para distinguirlo del Inhibidor de la Tripisina Pancreática que es una proteína intracelular que se encuentra únicamente en los rumiantes). Este inhibidor competitivo se une de manera tan intensa al centro activo de la tripsina que la inactiva de manera efectiva incluso a concentraciones muy bajas.

24. * Sin embargo la activación del pepsinógeno es un proceso mucho más simple: - El pepsinógeno es una proteína de masa molecular 40 kDa que se autohidroliza al bajar el pH, eliminándose un un péptido de naturaleza básica de 44 AAs del extremo N-terminal.

25. * La digestión ocurre espontáneamente a pH ácido y en ella intervienen de manera activa determinados restos de Asp. * Ahora bien, también hay procesos de activación por proteolisis limitada o parcial mucho más complejos, como por ejemplo los implicados en la coagulación sanguínea o en la fibrinolísis. * Así pues, en los casos en que unas proteasas activan a otras y/o se autoactivan lo que tiene lugar es una activación en cascada, consiguiéndose una respuesta rápida y amplificada.

26. *2.1.2.Modificación covalente reversible * Actualmente sabemos que un elevado número de enzimas existen en dos formas (con propiedades catalíticas diferentes), que se pueden interconvertir una en otra gracias a la acción de otras enzimas. * Estas enzimas sufren un cambio en la actividad debido a la modificación covalente de algunos restos aminoacídicos de la cadena polipeptídica. - Las principales modificaciones covalentes que conducen a una modificación de la actividad enzimática (activa <--> inactiva) son: * Fosforilación <==> Desfosforilación * Acetilación <==> Desacetilación * Adenilación <==> Desadenilación * Uridilación <==> Desurilación * ADP-ribosilación

27. - El paso de una forma a otra, generalmente, tiene lugar gracias a una enzima convertidora (Ec), siendo el sustrato la enzima interconvertible (Eic) Proteina quinasa ATP ADP E-OH E-O-P a) b) H2O Proteina fosfatasa P La nomenclatura aceptada, es llamar a) a la forma activa de la enzima interconvertible y b) a la forma inactiva:

28. Ventajas de este sistema de regulación a) Un pequeño consumo energético Rápido cambio en la cantidad de enzima b) Cambios en la enzima activa del todo/nada c) Permite la amplificación de una señal, pueden depender en su actividad de señales (segundos mensajeros) intracelulares d)Sistemas de enzimas interconvertibles en cascadas permite la amplificación de señal más extensa

29. - Un ejemplo clásico es el de la glucógeno fosforilasa que cataliza la siguiente reacción: Glucógeno Fosforilasa (Glucógeno)n + Pi== (Glucógeno)n-1 + D-Glucosa-1-P

32. En una serie de reacciones conocidas como cascada reguladora, la señal hormonal que se produce por contacto, en la superficie celular, con el correspondiente receptor, se amplifica para convertir muchas moléculas de Fosforilasa-b en Fosforilasa-a. • Los iones Ca2+, que se liberan en las células musculares cuando se estimulan para que se contraigan, potencian este proceso. • * Así pues, el músculo puede responder rápidamente cuando necesita una cantidad de energía adicional. Phosphorylation inactivates Phosphorylation activates

33. Phosphorylation inactivates Phosphorylation activates Ahora bien, la fosforilación no necesarimente implica activación. From Meisenberg & Simmons, Fig. 17.16.

34. Gamma phosphoryl group * La fosforilación-desfosforilación reversible tiene lugar sobre restos aminoacídicos de: Ser, Thr o Tyr.

35. Las enzimas que catalizan la fosforilación se denominan: - proteina quinasas, o quinasas, y las que catalizan la desfosforilación. - proteina fosfatasas o fosfatasas. * La importancia de las proteina quinasas en la regulación de los procesos celulares viene reflejada por el gran número de genes presentes en los genomas eucariotas que codifican por este tipo de enzima. * En el hombre se calcula que hay unos 2000 genes que codifican por proteina quinasas y unos 1000 genes que codifican por proteina fosfatasas. * Las proteinas quinasas actúan sobre un gran número de proteínas diferentes (sustrato), por lo que sería inadecuado clasificarlas de acuerdo con la siguiente reacción general: Proteína + ATP = Fosfo-Proteína + ADP

36. * Inicialmente las podemos clasificar de acuerdo con el tipo de resto aminoacídico sobre el que tiene lugar la fosforilación: i)Ser/Thr ii)Tyr - Si bien también hay algunas protein quinasas que fosforilan restos de His, Lys, Arg, Gln, o Asp. * Mientras las fosforilaciónes sobre Ser/Thr están asociadas, generalmente, a procesos de regulación metabólica, la fosforilación sobre Tyr lo está con procesos de crecimiento celular y diferenciación. * Otra subdivisión de las protein-quinasas es la que puede hacerse en base a la naturaleza del regulador intracelular, ya que muchas protein-quinasas, aunque no todas, están controladas por un sistema de transducción de señales.

37. Familia Resto aminoacídico Regulador aceptor PK cAMP-dependientes Ser/Thr cAMP PK cGMP-dependientes Ser/Thr cGMP 2+ Protein quinasa C Ser/Thr Diacilglicerol, Ca 2+ 2+ PK Ca /calmodulina Ser/Thr Ca Kinasa ciclin- Ser/Thr Ciclinas dependiente Mitogen activated Ser/Thr Factores de crecimiento protein kinase Citoquinas (MAP kinase) Feromonas Receptor tyrosin Tyr Factores de crecimiento kinases Cytosolic tyrosin Tyr Citoquinas kinases * En la siguiente Tabla se muestra de manera resumida la clasificación de las proteín-quinasas:

38. Eca ATP ADP Eci(a) Eci(b) a) b) H2O Ecb P Ultrasensibilidad de orden cero Amplificación de la señal Ec (enzimas convertidoras) Orden cero [Ec] <<<<[substrato] la Enzima interconvertible Siempre en saturación

39. ORDEN 1 ORDEN O 1 Eb/Eo 0 1 Eb/Eo 0 v v`a v`a v b v a v b v a EE2 EE1 EE2 EE1 0 Ea/Eo 1,0 0 Ea/Eo 1,0 Las enzimas modificadoras o convertidoras deben estar a muy pequeña concentración en comparación con las enzimas interconvertibles Gran dificultad en el aislamiento y purificación de enzimas convertidoras

40. Resumen Todas las enzimas están sujetas a un continuo recambio. La cantidad actual de una proteína es el resultado de un proceso de síntesis y un proceso de degradación que actuan de forma simulánea. El recambio enzimático tiene las siguientes ventajas: a) la eliminación de proteínas defectuosas; b) la adaptación a nuevas situaciones metabólicas Las enzimas pueden ser constituivas (sus niveles estacionarios permanecen constantes) o inducibles (sus niveles varian de acuerdo a estímulos). El proceso de síntesis, desde el punto de vista cinético es un proceso de orden cero, no depende de la cantidad de proteína; la degradación, en cambio, es un proceso de orden uno y, generalmente, más rápido que el proceso de síntesis. El tiempo de vida media suele depender de la constante de degradación. La regulación por modificación covalente puede ser irrevesible y reversible. Irreversible es una proteolisis específica y controlada la sufren proteínas denominadas zimógenos convirtiéndose en una proteína activa. Estrategia de regulación más difundida es la modificación reversible en la estructura covalente de la enzima. Los cambios más comunes son fosforilación-desfosorilación, mediante la acción de enzimas convertidoras: proteínas quinasas y proteínas fosfatasas. La forma activa puede ser bien la forma fosforilada o la forma desfosforilada. Para que pueda darse un cambio notable de amplificación de la señal las enzimas convertidoras deben trabajar en orden cero de reacción, lo que supone que la concentración de las enzimas convertidoras es mucho menor que las enzimas interconvertible, sus substratos.