Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

1. Индуцированный мутагенез (количественные аспекты) А.В. Рубанович Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН rubanovich@vigg.ru

2. XIX век – Август Вейсман: безуспешные попытки изменить наследственность используя температуру, влажность и механические воздействия. 1925 – Г. А. Надсон (и его сотрудник Г. С. Филиппов) - Ленинградский Институт рентгенологии и радиологии: после воздействия рентгеновых лучей вырастали колонии дрожжей, отличавшиеся величиной, формой и окраской. 1927 - Герман Джозеф Меллер - V Международный генетический конгресс в Берлине: первые удачные опыты по искусственному вызыванию рецессивных мутаций с помощью рентгеновых лучей у дрозофилы. 1927 - Л. Стадлер: искусственные мутации у ячменя и кукурузы после воздействия рентгеновых лучей. История Расстрелян - 1939 Нобелевская премия - 1946

3. Биологическое действии радиации осознали значительно раньше! 1901 -Первый описанный случай радиационного ожога кожи 1906 -Первый летальный исход (США) 1911 - Первый описанный случай радиационно- индуцированной лейкемии 1946 – Первое описание«клинического синдрома обусловленного атомной бомбардировкой» 1936 - Обелиск в Гамбурге: имена 115 исследователей, погибших в результате действия радиации

4. 1 чайная ложка горячего кофе 2 секунды на пляже гибель в 50% случаев = = Радиобиологический парадокс: ничтожная энергия вызывает драматический биологический эффект! Полулетальная доза для человека = 4 Гр = 270 Дж = 67 кал По энергетическим затратам: 1920 - Фридрих Дессауер – «теория точечной теплоты»: радиация отдает энергию порциями, вызывая нагревание отдельных точек до очень высокой температуры. Далее локальное свертывание белков, что к ведет биологическому поражению.

5. Теория мишеней и принцип попадания (1946-1947) Карл Циммером (Гемания) Николай Владимирович Тимофеев-Ресовский (Россия) Дуглас Ли (Великобритания) Откуда взялись эти положения? В основном из характера дозовых зависимостей… • Ионизирующие излучения переносят энергию в дискретном виде • Акты взаимодействия (попадания) не зависят друг от друга и • подчиняются пуассоновскому распределению • Исследуемый эффект наступает, если число попаданий в некоторую • чувствительную область (мишень), равно определенному числу раз

6. Токсические воздействия: Радиация: Выживаемость, % Выживаемость, % 100 100 50 50 Доза облучения Время воздействия, концентрация Частота, % Частота, % 100 100 50 50 Доза, вызывающая гибель Время гибели Среднее время гибели Средняя убивающая доза Зависимость «доза-эффект» в радиобиологии S(D)=e-D Экспонента - порога нет! Порог Плотности распределений Кривая выживания – это функция распределения дозы (времени воздействия), вызывающей гибель

7. Человек Некоторые насекомые Выживаемость, % Выживаемость, % 100 100 50 50 Возраст 4000 75 Возраст Распределение продолжительности жизни для бессмертных! Единственная причина смерти – попадание под колеса автомобиля. Средняя продолжительность жизни  4000 лет Забудем на время о дозах – будем говорить о распределениях продолжительности жизни Вероятность умереть в следующем году увеличивается с возрастом Вероятность умереть в следующем году не зависит от возраста Экспоненциальная продолжительность жизни - это распределение «без памяти о прошлом»

8. Выживаемость, % Экспоненциальная зависимость: вероятность наступления эффекта при следующей порции облучения не зависит от предыдущей дозы 100 50 Доза облучения Положения теории попаданий в мишени • Ионизирующие излучения переносят энергию в дискретном виде • Акты взаимодействия (попадания) не зависят друг от друга и • подчиняются пуассоновскому распределению • Исследуемый эффект наступает, если число попаданий в некоторую • чувствительную область (мишень), равно определенному числу раз Вернемся к зависимостям «доза-эффект» Не только дозовые зависимости! Многое проясняет физика взаимодействия излучений с веществом

9. - т.е. способных производить ионизации атомов (выбивать электроны с орбит ) - Ядро атома - -частиы - - X-лучи (рентгеновское излучение) - - -частицы - - -лучи Виды ионизирующих излучений Рентгеновское излучение не связано с радиоактивностью Вильгельм Конрад Рентген и рука его жены (1895)

10. Эрнест Резерфорд (1899) е- Фотон 4Не 2 Число нейтронов X-лучи УФ -лучи Частота, Гц Длина волны, м Число протонов Природа ионизирующих излучений -частицы: - + + Pb + -лучи: Источник – радиоактиный изотоп, у которого ядра атомов нестабильны за счет избытка (или дефицита) нейтронов Источник – радиоактиный изотоп, у которого ядра атомов нестабильны за счет избытка нейтронов - -частицы: Ионизирующая способность

11. Ионизирующее излучение                   -         - - Ионизации и линейная передача энергии (ЛПЭ) Ионизированный атом - - - ЛПЭ = потери энергии ионизирующей частицы на единицу пути в веществе (E/s) Высокая ЛПЭ > 20 кэв/мкм (- частицы,протоны, нейтроны) Низкая ЛПЭ < 7 кэв/мкм (-лучи, X-лучи, -частицы)

12. Источники опасны только при поступлении в организм -лучи Прохождение излучений через вещество Бумага Бетон -частицы -частицы Пробег в ткани 0.1 – 3 мкм

13. Относительная биологическая эффективность излучения (ОБЭ)  p+  - 4 ОБЭ 3 2 1 0.1 1 10 100 1000 ЛПЭ, кэвмкм-1 ткани Единицы измерения доз Рентген, грей, бэр, рад, зиверт, рем…? • Поглощенная доза – энергия, выделенная в 1 кг вещества: • 1 Грей (Гр) =1 Дж/1 кг • Экспозиционная доза – мера ионизации (только для - и X-лучей) - • заряд (одного знака), образующийся в 1 см3 воздуха • 1 Рентген (Р) = 0,0088 Гр • Эффективная или эквивалентная доза – доза с учетом ОБЭ и • радиочувствительности пораженного органа • 1 зиверт (Зв) = 100 бэр Только для личного пользования! 1 Гр = 100 рад  100 Р  100 бэр  1 Зв Единицы измерения радоактивности Дозиметры меряют не дозу, а мощность дозы, т.е. поглощенную дозу в единицу времени (Гр/c) • Cкорость распада атамов: 1 беккерль (Бк) = 1 распад/сек • 1 Кюри (Кю) = 3,71010 Бк

14. Что является «мишенью»? Положения теории попаданий в мишени • Ионизирующие излучения переносят энергию в дискретном виде • Акты взаимодействия (попадания) не зависят друг от друга и • подчиняются пуассоновскому распределению • Исследуемый эффект наступает, если число попаданий в некоторую • чувствительную область (мишень), равно определенному числу раз

15. Ядро в 100 раз более чувствительно, чем цитоплазма Облучение хромосом в 200-300 эффективней, чем облучение цитоплазмы Идентификация мишени: ядро, хромосомы, ДНК • Микропучки -частиц с пробегом 40 мкм (210Ро): • избирательное облучение ядра • Микроразрезы: перенос необлученного ядра в облученную цитоплазму • Уридин (РНК, цитоплазма) и тимин (ДНК, ядро), помеченные тритием 3Н • (-излучатель, пробег 1-2 мкм) • Сенсибилизация клеток 5-бромдезоксиуридином • (BUdR подобен, но не идентичен тимину) • Радиочувствительность  содержание ДНК в клетках: • растения, насекомые, амфибии (объем интерфазных хромосом)

16.  2 мкм Свободный радикал OH электрически нейтрален, но имеет неспаренный электрон на внешней орбите - высокая реакционная способность (время жизни 10-10 с) Прямое и непрямое действие радиации • Непрямое действие - радиолиз воды и возникновение свободных радикалов при прохождении излучения через цитоплазму: • - наиболее активен радикал OH • (75% повреждений ДНК) • - преобладает при низких ЛПЭ (- и X-лучи) В любом случае речь идет о попадании в ДНК-мишень • Прямое действие - непосредственная ионизация атомов ДНК - преобладает при высоких ЛПЭ (-частицы, нейтроны)

17. На клетку: Дальнейшие события: Действие ионизирующих излучений • «Интерфазная гибель» - мгновенное прекращение метаболизма и разрушение клетки: большие дозы (> 20 Гр) • «Репродуктивная гибель» - потеря способности к неограниченному делению: низкие дозы (< 10 Гр): На хромосомы: • Однонитевые разрывы ДНК (низкое ЛПЭ) • Двунитевые разрывы ДНК (высокое ЛПЭ) • Повреждение оснований (особенно пиримидиновых). • Репарация • Хромосомные аберрации, мутации генов в половых и соматических клетках (рак)

18. Распределение «редких событий»: • - число рыбок, пойманных за «время» D - число изюминок в кексе «объема» D - число голосов за Жириновского в квартале с Dжителями - среднее число попаданий при дозе D Попадания в мишени: распределение Пуассона   объем мишени Вероятность отсутствия поражений, т.е. выживаемость при «одноударном» механизме гибели …………

19. Выживаемость, % 100 50 Доза облучения Выживаемость, % D37 1 Доза облучения 0.37  0.1 • доза, вызывающая 63% гибели: 0.01 Модель гибели «одна одноударная мишень» S(D)=e-D По оси ординат ln S(D)=-D Удобен «полулогарифмический» масштаб: Первые правильные оценки размера генов в хромосомах. Задолго до «двойной спирали»! 1-2 Гр для клеток млекопитающих 500 Гр - вирусы

20. Жива Жива Погибла m Выживаемость, % 1 Доза облучения 0.1  0.01 Модель гибели «несколько одноударных мишеней» Пусть для инактивации клетки небходимо попадание в m мишеней, например при m=2 : S(D)=1 – (1-e-D)m Вероятность попасть в одну мишень (хотя бы раз!) Оценка «числа мишеней»! «Плечо»

21. _ • D - в теории вероятностей _ 50 D = Площадь под кривой выживания в линейном масштабе 37 D50 D37 Выживаемость, % 100 Выживаемость, % 50 100 D 50 D - средняя доза, вызывающая гибель _ _ D = D Численные оценки радиочувствительности Выживаемость, % • D50 - в токсикологии 100 • D37 - в радиобиологии D Процедура нахождения площади более устойчива к разбросу точек, по сравнению с алгоритмами вычисления D50или D37

22. ………… и т.д. – распределение Пуассона Одноударный эффект Двухударный эффект Эффект (мутации, аберрации) 2 удара 1 удар Доза облучения Одноударные и многоударные эффекты

23. Центрические кольца + фрагменты • (2 разрыва в одной хромосоме) • Дицентрики + фрагменты • (2 разрыва в разных хромосомах) Радиационно-специфические аберрации хромосом

24.   1.5 n  X Частота дицентриков  5 0 Доза, Гр Одноударные и многоударные эффекты 2 разрыва за 2 удара  D2 При увеличении ЛПЭ кривая становится одноударной 1.6 1.2 Число дицентриков на клетку 0.8 0.4 Выход дицентриков D+ D2 2 разрыва за 1 удар  D 0 2 4 6 Доза, Гр

25. Калибровочная регрессия зависимости частоты дицентриков и центрических колец на дозу -облучения (облучение лимфоцитов in vitro) y = 0,001 + 0,015 D + 0,063 D2 Биодозиметрия • Обнаружение хромосомных аберраций в лимфоцитах крови • – доказательство недавнего облучения организма • Возможны более точные оценки индивидуальной дозы по данным, • полученным при облучении лимфоцитов in vitro Минимальная доза, которую можно выявить при анализе лимфоцитов составляет 0.1 – 0.2 Гр Частота аберраций у пациента Доза, полученная пациентом В.А. Шевченко, 2002

26. Влияние мощности дозы на частоту микроядер de Toledo et al.2006 При уменьшении мощности дозы Репарация Ацентрические фрагменты хромосом исключенные из клеточных ядер в момент деления клеток

27. X-лучи: 0,01 Гр/мин X-лучи: 1 Гр/мин При увеличении мощности дозы и ЛПЭ излучения Нейтроны: 0.01 Гр/мин Нейтроны: 1 Гр/мин Репарация – зависимость выживаемости от мощности дозы • Репарации обнаруживается по изменению наклона кривых «доза-эффект»: • при изменении мощности дозы • при фракционированном облучении 1 10-1 10-2 10-3 10-4 0 2 4 6 8 10 Доза, Гр

28. X-лучи: 1Гр/мин При увеличении мощности дозы и ЛПЭ излучения X-лучи: 0,003 Гр/мин Принцип «беспороговости» и «кумулятивности» мутационного процесса Выход Х-сцепленных рецессивных леталей у дрозофилы не зависит от мощности дозы в диапазоне 0.03 - 100 Гр/час Репарация – зависимость выхода дицентриков от мощности дозы Нейтроны, энергия 0.714.7 Мэв 2.0 1.5 1.0 Частота дицентриков на клетку 0.5 D.C. Lloyd (1981) 0 1 2 3 4 5 Доза, Гр

29. Проект «MegaMouse»супругов L.B.Russell &W. L. Russell (1955-1965) 7 морфологических мутаций 7 миллионов мышей! Индукция морфологических мутаций в потомстве облученных родителей Пять главных выводов • Выход различных мутаций на 1 Гр различается в 30 раз. • Эффект мощности дозы существенен. Хроническое облучение вызывает меньше мутаций, чем острое (в отличии от Drosophila) • Самцы более радиочувствительны, чем самки. • Генетические эффекты существенно уменьшаются, • если увеличивается время между облучением и спариванием. • Удваивающая доза для частоты мутаций равна 1 Gy. 1 Гр The frequency of radiation-induced mutations is not, as the classical view holds, independent of dose rate. W. L. Russell, L. B. Russell. Science, 19, 1958

30. Всем спасибо, и еще раз напомню: • Биологические эффекты ионизирующих излучений в основном связаны с • воздействием на ядерное ДНК • Экспоненциальная зависимость выживаемости от дозы означает гибель от • случайных и независимых актов поражения • Квадратичная зависимость от дозы указывает на двухударный механизм • формирования эффекта • Зависимость кривой «доза-эффект» от мощности дозы указывает на • присутствие репарации • Для млекопитающих доза, удваивающая частоту мутаций в потомстве  1 Гр • 1 Гр  100 рентген, хотя это разные вещи Копию презентации можно скачать на сайте ИОГен: www.vigg.ru