460 likes | 734 Views
Analisis Potensi dan Karakterisasi Molekuler Gen 16S rRNA Bakteri Selulolitik yang Diisolasi dari Makroalga Eucheuma sp dan Sargassum sp Sebagai Penghasil Enzim Selulase. KOMPREHENSIF. Muhammad Luthfi Ramadhan NPM 230110080120.
E N D
AnalisisPotensidanKarakterisasiMolekuler Gen 16S rRNABakteriSelulolitik yang DiisolasidariMakroalgaEucheumasp danSargassumsp SebagaiPenghasilEnzimSelulase KOMPREHENSIF Muhammad LuthfiRamadhan NPM 230110080120 DibawahBimbingan:Ir. Ibnu Dwi Buwono, M.SiYuniarMulyani, SP., M.Si
LATAR BELAKANG • KandunganMakroalga • PotensiMakroalgadi Indonesia • Pemanfaatanbakteriselulolitik
IDENTIFIKASI MASALAH • Bakteriselulolitik yang diisolasidarimakroalgadapatberperansebagaipenghasilenzimselulase. • Karakterisasimolekuler 16S rRNAuntukmengetahuijenisbakteriselulolitiktersebut
TUJUAN PENELITIAN • MendapatkanisolatmurnibakteridarimakroalgaEucheuma sp danSargassum sp danmengujipotensibakteritersebutdalammenghasilkanenzimselulase. • Melakukankarakterisasimolekuler 16S rRNApadaduaIsolatterbaik.
KEGUNAAN Bakteriselulolitik yang didapatdarisubstrataslinyadiharapkanmampumenguraikanselulosalebihbaik.
WaktuPenelitian Penelitianinidilakukandalam 2 tahap, yaitu: • TahappersiapanberupapersiapansampeldanisolasibakteritelahdilakukanpadabulanFebruari - Maret 2012 • PenelitianUtamayaituujiaktivitasselulolitikdankarakterisasimolekular 16S rRNAtelahdilaksanakanpadabulan April-Juni 2012
TEMPAT Penelitian • Lokasi sampling makroalgadilakukandisekitarPantaiPalabuhanRatu PelaksanaanpenelitiandilakukandiLaboratoriumBioteknologiPerikanandanIlmuKelautanUniversitasPadjadjaran
ALAT DAN BAHAN ALAT AnalisisMolekuler Identifikasibakteri Sampling Isolasibakteri Uji/ Screening AktivitasBakteri
Bahan Identifikasi & Uji Screening Sampling & IsolasiBakteri
AnalisisMolekuler Bahan
Prosedurpenelitian Sampling makroalga ↓ isolasi Kultivasibakteri (medium marine agar) ↓ subkultur s/d isolattunggal Uji/ skrining (aktivitasselulolitik) ↓ Pengambilan 2 isolatterbaik ↓ AnalisisMolekuler 16S rRNA ↓ Sequencing Analisisbioinformatik
SampelEucheuma sp padastasiun 1 SampelEucheuma sp padastasiun 2 SampelSargassum sp padastasiun 3 SampelSargassumsp padastasiun 4
IsolasidanPewarnaan Gram Bakteri HasilIsolasidanIdentifikasiPewarnaanBakteriSampelEucheuma sp. Perbedaanwarnapadakolonibakteriterjadikarenaperbedaanpigmenintraseluler yang dihasilkanolehbakteri. Sedangkanpadapewarnaan gram bakteridipengaruhiolehdindingsel, Strukturdindingselbakteri gram positifberbedadenganstrukturbakteri gram negatif Data HasilIsolasidanIdentifikasiPewarnaanBakteriSampelSargassum sp
UjiAktivitasSelulolitik UjiAktivitasSelulolitikpadaIsolatBakteriSampelEucheuma sp. Pengujianaktivitasselulolitikpadaisolatbakteri yang didapat, dilakukandenganmenambahkan CMC (Carboxy Methyl Celullose)1% pada medium marine agar. Hal iniberfungsiuntukmelihatrespondariisolatbakteri yang didapatterhadapselulosa UjiAktivitasSelulolitikpadaIsolatBakteriSampelSargassum sp.
UjiAktivitasSelulolitikHasilPewarnaanRed congo (Isolat C.2) Padapengujianaktivitasselulolitikdenganpenambahan CMC 1%, adanyazonabeningtidaktampaksecara visual, sehinggadilakukanpewarnaanmenggunakanred congountukmelihatzonabening yang dihasilkan.
KarakterisasiMolekuler Isolasi DNA GenomBakteri Nilai OD B.1.2 = 1,279 ; Konsentrasi= 2,750µg/ml C.2 = 1,364; Konsentrasi= 3,000µg/ml HasilElektroforesisIsolasi DNA Genom Keterangan: B.1.2 = IsolatBakteriKode B.1.2 C.2 = IsolatBakteriKode C.2 M = Marker DNA Ladder 1 kb
KarakterisasiMolekuler Amplifikasi Gen 16S rRNA menunjukanbahwa pita dariprodukamplifikasi (Amplikon) beradapadaukuran 1.500 bpsesuaidengan target amplifikasidari primer 16S rRNA yang digunakan. Sehinggasampelhasilamplifikasitersebutdapatdilanjutkanketahapselanjutnyayaitusekuensing ElektroforesisHasilAmplifikasi Gen 16S rRNA Keterangan: B.1.2 = HasilAmplifikasi 16S rRNAIsolatBakteriKode B.1.2 C.2 = HasilAmplifikasi 16S rRNAIsolatBakteriKode C.2 M = Marker DNA Ladder 1 kb - = KontrolNegatif
KarakterisasiMolekuler Hasilpurifikasiprodukamplifikasimenunjukanbahwa pita produkamplifikasi yang akandisekuensingberadapadaukuran 1.500 bp. HasilPurifikasiprodukAmplifikasioleh 1st BASE Keterangan: • : KodeBakteri B.1.2 • : KodeBakteri C.2 1kb DNA Ladder (bp) : 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 5000, 6000, 8000, 10000
SekuensingHasilAmplifikasi Gen 16S rRNA Hasil Sequencing Sampel B.1.2 Hasil Sequencing Sampel C.2 AnalisisBioinformatik Hasil Sequencing 16S rRNA Forward Hasil Sequencing 16S rRNA Reverse Pengolahan Data Bioedit Data KonsensusSampel C. 2 Data KonsensusSampel B.1.2
Analisisinidilakukanuntukmengetahuispesiesbakteridenganmencocokan data yang adadigene bank. AnalisisHasil BLAST-N Hasil BLAST –N pada website http//www.ncbi.nlm.nih.gov Data hasil yang diperolehmenunjukansemuasampelmemilikitingkatkesesuaian/ homologi yang tinggiyaitu 97% (Query Coverage) dan 99% (Max Ident) dengan data diGeneBank
Enzim dari strain Bacillus thuringiensis dapat diterapkan dalam biokonversi biomassa lignoselulosa menjadi gula melaluifermentasi (Lin et al 2012). PotensiSelulolitikBacillus subtilisdanBacillus thuringiensis • Bacillus subtilis • Strain Bacillus subtilis dapat digunakan untuk mendegradasi substrat selulosa seperti sekam padi, tebu ampas tebu, dan rumput liar (Dekaet al 2011). • Bacillus thuringiensis
Kesimpulan • Dari kelimaIsolatbakteripenghasilzonabening, isolatbakteridengankode B.1.2 dan C.2 merupakanisolat yang memilikiindeksselulolitikterbesarpadapengujianaktivitasselulolitikmenggunakanpenambahan CMC 1% pada medium marine agar yaitu 2,477 mm dan 6,102 mm. • Hasilkarakterisasimolekulerdengan gen penyandi 16S rRNApadakedua isolate bakteripenghasilindeksselulolitikterbesar, mendapatkanhasilsequen yang memilikikesamaanatauhomologi yang tinggiyaitu 97% padahasil BLAST di website http//www.ncbi.nlm.nih.gov. • KodeIsolat B.1.2 darisampelEucheuma sp memilikikesamaandenganBacillus subtilis, sedangkankodeisolat C.2 dariSargassum sp memilikikesamaandenganBacillus thuringiensis. Hasilanalisisberdasarkan data sekunderdarijurnal-jurnalpenelitiansebelumnya, menyatakanbahwakeduabakteritersebutmemilikipotensiuntukdikembangkansebagaibakteripenghasilenzimselulase. Saran Perludilakukanpenelitianlanjutanuntukmengetahui/ mengeksplorasienzim yang dihasilkandaribakteriBacillus subtilisdanBacillus thuringiensis. Serta perludilakukanisolasienzimselulase yang dihasilkandarikeduabakteritersebut, sehinggaenzim yang dihasilkandapatdiaplikasikankearahbioprosesuntukpengolahanbioetanol
PotensiMakroalga • DalamekspedisiLautSibolga 1899-1900 oleh Van Bosseditemukankuranglebih 555 jenismakroalgadiperairan Indonesia (Anggadiredja, 2008). • Tingginya total produksimakroalga.
Hasil Sequencing Sampel B.1.2 Hasil Sequencing 16S rRNA Forward NNNNNNNNGNCNNNNTNCNGCGGGCTGGCTCCTAAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCNTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCATAATTCCGGACNACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGNACCGTCAAGGNACCGCCCTATCGAACGGNACTGTCTNCCTACAACGANNTTACGATCCGGAAAANNNNTCACTTCNNCGCNTNNTNCGTCGACTTNGTCATGCGANATCNNNNNCTGCNTCCGANGANCNGGNCCNNNNNNNNNCCANNGNGNCCGANCACCCTNNTCCAG Hasil Sequencing 16S rRNA Reverse NNNNNNNNNNNGGNNNNNTATAATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGNGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCNCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTTCGGGGCAGANNGACNGGNGTTGCANGNTGTCCGN
Data KonsensusSampel B.1.2 NNNNNNNNGNCNNNNTNCNGCGGGCTGGCTCCTAAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGRMMACCATGCAMCACCTGTCACTCTGCCCCSRAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGRAAAMCTTCATCACTYMCGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCNTCMRGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTTTGAACCATGCGGTTCAAACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACNCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTGCATTATANNNNNCCNNNNNNNNNNN
Hasil Sequencing Sampel C.2 Hasil Sequencing 16S rRNA Forward NNNNNNNNNNCNNCTTNNGCGGCTGGCTCCAAAAGGTTACCCCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAACGGTTTTATGAGATTAGCTCCACCTCGCGGTCTTGCAGCTCTTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTTAATGATGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCTCCCGAAGGAGAAGCCCTATCTCTAGGGTTTTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAACTTCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGTGTCAGTTACAGACCAGAAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCATATCTCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTTTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCGTGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCACCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGATAACGNTTGNCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTANTTANCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCNAAGTGCCAGCTTATTCAACTAGCACTGTCTTCCCTACCACANATTTACGACCCGAAAGCTTCATCACTCANGCGCGTTGCTNCGNNNACTTCGTCCATGCGGANATCCCTACTGCTGCCTCCGTAGAGTCTGGGCCGNGNNTNNNTCCCAGGNGNGCCNNATNNCCNNNNNNNTCCGGCNN Hasil Sequencing 16S rRNA Reverse NNNNNNNGNNNGCNNNNNTANAATGCAAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCANGTCTTGACATCCTCTGAAAACCCTAGAGATAGGGGCTTCTCCTTCGGGANCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGGAGATGNTGGGTTAAGTNCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCATCATTAAGTTGGGCACTCTAANGTNACTGCCGGNGACAAACCGNNGNAAGGTGGGNATGACNNCAANNCNNCNNNNNNCCNNNNNNN
Data Consensus Sampel C.2 NNNNNNNNNNCNNCTTNNGCGGCTGGCTCCAAAAGGTTACCCCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAACGGTTTTATGAGATTAGCTCCACCTCGCGGTCTTGCAGCTCTTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATNGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTTAATGATGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGNACTTAACCCAACATCTCCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCTCCCGAAGGAGAAGCCCCTATCTCTAGGGTTTTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAACTTCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGTGTCAGTTACAGACCAGAAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCATATCTCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTTTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCGTGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCACCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAARGTGCCAGCTTATTCAACTAGCACTTGTTCTTCCCTAMCAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGKGKGGCCGNATCACCCTCTCAGKYCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGACGCGGGTCCATCCATAAGTGACAGCCGAAGCCGCCTTTCAATTTCGAACCATGCGGTTCAAAATGTTATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTATGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACTTCATAAGAGCAAGCTCTTAATCCATTCGCTCGACTTGCATTNTANNNNNGCNNNCNNNNNNN