Promotori eucariotici

1. Promotori eucariotici • RNA pol I trascrive rRNA • RNA pol II trascrive mRNA per proteine • RNA pol III trascrive tRNA e 5S rRNA

2. LE RNA POLIMERASI COME RICONOSCONO I PROMOTORI? Transcribed region Promotore -contiene sequenze Specifiche per il legame della polimerasi

3. FATTORI DI TRASCRIZIONE • FATTORI DI TRASCRIZIONE GENERALI (BASALI) - RICONOSCONO ELEMENTI “core promoter” • REGOLATORI SPECIFICI - ATTIVATORI - REPRESSORI Basal factor binding sites Transcribed region ELEMENTO ENHANCER ELEMENTO DEL PROMOTORE PROSSIMALE

4. Il legame promotore RNA polimerasi richiede i fattori di trascrizione generali

5. ~200 bp gene Promotori

6. COME IDENTIFICARE ELEMENTI NEL PROMOTORE ATTIVITA’ 100% Reporter gene eg CAT, luciferase 100% Reporter gene 20% Reporter gene 1% Reporter gene 0% Reporter gene

7. COME IDENTIFICARE ELEMENTI NEL PROMOTORE ATTIVITA’ 100% Reporter gene eg CAT, luciferase 100% Reporter gene 400% Reporter gene 1% Reporter gene 0% Reporter gene

8. attivato basale Livello di trascrizione represso

9. Elementi del Core promoter • siti di legame per I fattori di trascrizione generali Che supportano un livello di trascrizione basale La regolazione della trascrizione e’ ottenuta dalla Azione di fattori di trascrizione gene-specifici Transcribed region

10. RNAP II Inr DPE BRE TATA ~24bp TATA-box 8 bp elemento ricco in AT Bound by TFIID BRE 6 bp elemento ricco in purine Bound by TFIIB Inr DPE Bound by TFIID

11. TFIID TFIIE TFIIH TFIIF 2 subunits 2 subunits RNAP II TFIIA 2-3 subunits 12 subunits 10 subunits TFIIB 1 subunit ~40 polipeptidi 9 subunits

12. RNAP II Inr DPE BRE TATA ~24bp TATA-box 8 bp AT lega TFIID BRE 6 bp lega TFIIB Inr DPE lega TFIID

16. TFIIF Inr DPE BRE TATA ~24bp RNAP II TFIID TFIIB TFIIE TFIIH TFIIA

18. TFIID contiene la TATA-Box Binding Protein TBP TFIID

19. TFIID e’ composta da vari TBP Associated Factors —TAFs -aiutano il posizionamento di TFIID riconoscendo L’elemento Inr -legano i fattori di trascrizione gene specifici -aiutano a decompattare la cromatina

20. Inr DPE BRE TATA ~24bp TFIID

21. Inr DPE BRE TATA ~24bp TFIID TFIIA TFIIA -aumenta e stabilizza il legame di TBP al DNA -interagisce con vari attivatori gene specifici Aiutandoli a legarsi ai vari TAF

22. Inr DPE BRE TATA ~24bp TFIID TFIIB TFIIB TFIIA -si lega a TBP e richiama la polimerasi -Partecipa alla selezione del sito d’inizio e Stabilisce la direzione

23. TFIIF Inr DPE BRE TATA ~24bp RNAP II TFIID TFIIB TFIIF TFIIA Stabilizza il complesso di preinizio e induce Una torsione nel DNA

24. TFIIF Inr DPE BRE TATA ~24bp RNAP II TFIID TFIIB TFIIE TFIIE TFIIA Attira una elicasi ed insieme srotolano il Promotore. Stimola l’attivita’ chinasica di TFIIH

25. TFIIF Inr DPE BRE TATA ~24bp RNAP II TFIID TFIIB TFIIE TFIIH TFIIH TFIIA Fosforila una delle subunita’ della polimerasi dando l’avvio alla trascrizione

26. — REGOLATORI GENE SPECIFICI Transcribed region SI LEGANO A SEQUENZE REGOLATORIE

27. Regolatori gene specifici • hanno una struttura modulare • contengono un dominio che lega il DNA • contengono uno o piu’ domini di attivazione trascrizionale • qualche volta contengono uno o piu’ domini di repressione • qualche volta contengono un dominio di dimerizzazione

32. (MADS box)

33. O C H N H Donatore Accettore

34. A D A M A A D M A D A D A A A A A D A A A A D A

35. Regolatori gene specifici • Contengono un dominio che lega il DNA • E un dominio di attivazione trascrizionale Transcribed region

36. DNA loop Gli Attivatori come influenzano la trascrizione di un gene distante molte migliaia di nucleotidi?

37. Enhancers- stimolano la trascrizione • Attivatori si legano ad un sito specifico • Il DNA si ripiega

38. Enhancers- stimolano la trascrizione Attivatori si legano ad un sito specifico Il DNA si ripiega Si forma il complesso nel promotore

39. Enhancers- stimolano la trascrizione Attivatori si legano ad un sito specifico Il DNA si ripiega Si forma il complesso nel promotore Si lega la RNA polimerasi Inizio della trascrizione

40. Controllo combinatorialedell’espressione genica

41. Con poche proteine regolatorie si possono controllare un elevato numero di geni Diverse combinazioni producono fenotipi differenti

42. Heterodimerization of DNA binding proteins can alter their sequence specificity

43. RNAP enhancer interagiscono con RNAP trascrizione repressore previene il legame dell’enhancer Enhancer e Repressori promotore enhancer gene 10-50,000 bp repressore

44. Recettori nucleari • Fattori di trascrizione regolati da molecole idrofobiche • Cambio dell’attivita’ • Cambio della localizzazione cellulare

45. TBP RNA pol II TAF TAF TAF TAF Recettori nucleari Il legame del ligando causa cambiamenti conformazionali RGRACANNNTGTYCY

46. Nuclear Receptors GR hsp90 TATA GR GR GR GR Legame dell’ormone Dissociazione da hsp90 GR hsp90 dimerizzazione Migrazione nel nucleo Legame al DNA

47. Regolazione mediante fosforilazione • Ormoni attivano una chinasi • La chinasi fosforila un fattore di trascrizione • Il fattore e’ attivato

48. MEKK MEKK P P P P SEK SEK JNK JNK Cascata delle chinasi GF si lega al recettore - protein tyrosine kinase Il recettore dimerizza Il complesso fosforila MEKK – (MAP kinase kinase kinase) MEKK fosforila SEK – una MAP kinase kinase SEK fosforila JNK – una MAP kinase

49. RNA pol II P P C-FOS P C-JUN C-JUN JNK Cascata delle chinasi JNK attivata migra nel nucleo e fosforila il fattore di trascrizione C-JUN C-JUN dimerizza with C-FOS per formare AP-1 AP-1 attiva la trascrizione legandosi a –TGA(C/G)TCA- e interagendo con I fattori di trascrizione generali nucleo TRE