Systémy pre mutagenézu (T4 vs Pfu)

1. Systémy premutagenézu(T4 vs Pfu) Martin Janitor, PhD. Lambda Life a.s.

2. Mutagenéza v praxi Nešpecifická mutagenéza • radiácia • UV žiarenie • chemické látky Špecifická mutagenéza • bodové mutácie • viacnásobné bodové mutácie • inzercie • delécie

3. } } } } } } } } } WT mut T4 DNA Polymeráza Pfu DNA Polymeráza mut WT mut WT PriebehPfuaT4DNAmutagenézy

4. PROMEGAsystémy pre mutagenézu PROMEGA GeneEditor System™ - - určený na bodové mutácie - viacnásobné simultánne bodové mutácie (2-5) - inzercie - delécie (do 700 bp) - pozitívna selekcia mutantov PROMEGA Altered Sites™ II in vitro Mutagenesis System – - určený na bodové mutácie - viacnásobné bodové mutácie v cyklických krokoch - inzercie - delécie - pozitívna selekcia mutantov - in vitro a in vivo expresia PROMEGA Erase – a – Base System – - pre rýchlu konštrukciu 5´ delečných mutantov - delécie môžu dosiahnuť dĺžku niekoľkých kb

5. } } GeneEditor Mutagenesis System- bodové mutácie - GEN 1 gen 1 } } T4 syntéza + ligácia WT mut replikácia mut- Ampr Ampr+ anelácia gen 1 • použiteľný akýkoľvek konštrukt s Ampr génom • vhodný pre mutácie, delécie, inzercie • reakcia obsahuje všetky reagencie (T4 DNA Polymeráza, T4 DNA Ligáza, mutS a JM109 kompet. bunky) • dodávaný s Top a Bottom oligo • mutagenéza trvá max. 90 minút • úspešnosť cca 98% • zachováva sa Amp rezistencia mut Ampr+ Selekcia LB+AB Mix

6. } } } } } gen 1 } } } } } } mut Ampr+ GeneEditor Mutagenesis System- viacnásobné bodové mutácie - GEN 1 gen 1 } 2 až 5 T4 syntéza + ligácia WT mut replikácia mut- Ampr Ampr+ anelácia • použiteľný akýkoľvek konštrukt s Ampr génom • vhodný pre viacnásobnémutácie, delécie, inzercie • reakcia obsahuje všetky reagencie (T4 DNA Polymeráza, T4 DNA Ligáza, mutS a JM109 kompet. bunky) • dodávaný s Top a Bottom oligo • mutagenéza trvá max. 90 minút • úspešnosťcca 95%pocca 30% (pri 5 rôznych oligo) • zachováva sa Amp rezistencia Selekcia LB+AB Mix

7. GEN 1 gen 1 } } mut 1 WT pALTER Ampr Tetr x Tetr Ampr x Tetr x Ampr gen 1 } } } } } } anelácia a syntéza mut 1 gen 1 } } } Ampr } } Tetr x mut2 mut 2 Ampr X Tetr Tetr } Ampr x denaturácia Tetr mut 2 Ampr x Altered Sites™ II in vitro Mutagenesis System- bodové mutácie - syntéza mut 1 replikácia mut- LB+Amp anelácia replikácia mut- LB+Tet

8. inzert 3´ prečnievajúci alebo chráneným s alpha- phosphorothioate NTPs priming site 5´ prečnievajúci alebo tupý koniec štiepenie vhodnými RE Exo III v časových intervaloch S 1 nukleáza Klenow dNTPs T4 DNA Ligase PROMEGA Erase – a - base System - 5´ delečné mutácie -

9. Aplikácie PROMEGA systémov pre mutagenézu

10. PROMEGA Mutagenesis Systems- T4 DNA Polymerase vsPfu DNA Polymerase - GeneEditor Mutagenesis System Q9280 23 168 Sk s DPH Altered Sites II in vitro Mutagenesis System Q6210 17 152 Sk s DPH Altered Sites II Ex1 in vitro Mutagenesis System Q6090 19 755 Sk s DPH Altered Sites II Ex2 in vitro Mutagenesis System Q6080 19 755 Sk s DPH Altered Sites Mammalian Mutagenesis System Q5590 20 565 Sk s DPH