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DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA. IDENTIFICACIÓN DE MARCADORES MOLECULARES MICROSATÉLITES PARA LA DETECCIÓN DE MEZCLAS DE ALMENDRAS DE CACAO ( THEOBROMA CACAO L.) TIPO NACIONAL CON LA VARIEDAD CCN-51. Previo a la obtención del título de:.

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  1. DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA IDENTIFICACIÓN DE MARCADORES MOLECULARES MICROSATÉLITES PARA LA DETECCIÓN DE MEZCLAS DE ALMENDRAS DE CACAO (THEOBROMA CACAO L.) TIPO NACIONAL CON LA VARIEDAD CCN-51 Previo a la obtención del título de: INGENIERO EN BIOTECNOLOGÍA Elaborado por: David Alejandro Jarrín Escudero Directora: Dra. Karina Proaño Codirector: Ing. Marco Taipe

  2. INTRODUCCIÓN El cacao (Theobroma cacao L.) • Es la mas conocida especie del género Theobroma. • Theo = Dios y broma = alimento. • Es una especie diploide (2n = 20). • Originada en alto Amazonas (Centros de diversidad). • Sin embargo, es en Centro América donde se domesticó hace aproximadamente 3000 años. • Es uno de los géneros más antiguos y con mayor potencial económico a nivel local, regional y mundial. • Y en esta especie la variedad de cacao tipo Nacional es una de las mas destacables.

  3. INTRODUCCIÓN El cacao Nacional • El cacao se lo considera el producto símbolo del país. • Se estima que estuvo presente desde el tiempo de los Incas (siglo XII) y proviene de la Amazonía. • Francisco Pizarro relata su presencia entre 1526 y 1527. • A principios del siglo XVIII comienza el auge de su comercialización en los bordes del río Guayas. • En 1904 el Ecuador fue el mayor productor y exportador mundial de cacao. • La variedad Nacional se mantuvo exclusiva hasta 1890.

  4. INTRODUCCIÓN Estructura de la variedad Nacional • Introducción de material foráneo • Descendencia híbrida complejo Nacional

  5. INTRODUCCIÓN La comercialización del cacao • Se producen 4 millones de TM. de cacao en el mundo. • El 95% es cacao ordinario. • El restante 5 % es cacao fino. • El cacao fino o de aroma proviene de 17 países Suramérica, América Central, Islas del Caribe y Sudeste asiático. • Las características de aroma y sabor determinan un premio en los mercados internacionales

  6. INTRODUCCIÓN • Ecuador lidera la producción mundial de cacao fino (61%). • USD 535’000.000 en exportaciones de grano y elaborados (2011). • Los buenos precios en los últimos años, la creciente demanda y el declive del café  superficie cultivada (500.000 ha). Comunidad Europea

  7. INTRODUCCIÓN El cacao CCN-51 • El CCN-51 se registra desde el año 1960. • Agr. Homero Castro Zurita  “Colección Castro Naranjal”. • Originado de un doble cruzamiento (IMC 67 x ICS 95) x Canelo. • Medianamente resistente a la Escoba de Bruja y la Monilla. • Su rendimiento supera a las variedades clásicas cuando se cultiva con mediana y alta tecnología. • Buen índice de semilla, proporción elevada de grasa, peso y tamaño del grano y muy poca cáscara.

  8. INTRODUCCIÓN Nacional • En el 2003 no registró cantidades exportadas de CCN51. • En el 2011 se registró un 29,03% del total nacional exportado. • El problema de las mezclas es la subsecuente degradación del sabor del cacao del tipo Nacional. • La mezcla de cacao tipo Nacional con CCN-51 ha tomado fuerza (agresiva). • La ICCO amenaza con una nueva reducción  grandes perdidas a la cadena. CCN-51

  9. INTRODUCCIÓN • En elEcuadorla comercialización del cacao se lleva a cabo únicamente considerando parámetros físicos (INEN Nº 176). • Internacionalmente no existe un consenso de que parámetros usar. • Partículas extrañas • Cáscara • Grosor del grano • Contenido de agua • Contenido de grasa • Compuestos aromáticos y residuos de pesticidas • Denominación de origen

  10. INTRODUCCIÓN Técnicas en estudio Encontrar estrategias que posibiliten la detección de mezclas de cacao tipo Nacional con CCN-51. • Análisis químicos. • La radiación ultravioleta. • La radiación visible en cuerpos opacos. • NIRS (NearInfraredReflectanceSpectrometry). CCN-51 CCN-51

  11. INTRODUCCIÓN Marcadores Moleculares Hipervariabilidad Abundancia en el genoma SSR Herencia mendeliano Codominante Alta reproducibilidad

  12. INTRODUCCIÓN Objetivo General Desarrollar mediante el uso de marcadores moleculares microsatélites una metodología que permita detectar la existencia de mezcla entre almendras de cacao del tipo Nacional con la variedad CCN-51. • Seleccionar un protocolo de extracción a nivel de semilla que permita obtener un ADN de calidad y cantidad necesaria para amplificación por PCR. • Seleccionar marcadores moleculares SSRs para detectar la presencia de almendras de cacao CCN-51 en muestras de cacao del tipo Nacional. • Identificar alelos microsatélites específicos que permitan discriminar entre la variedad CCN-51 y el tipo Nacional. Objetivos específicos

  13. INTRODUCCIÓN Hipótesis • Ho = Los marcadores moleculares utilizados no amplifican específicamente para la variedad clonal CCN– 51.

  14. MATERIALES Y MÉTODOS Material vegetal G1: Nacional G2: CCN-51 M1: Doyle & Doyle (1987) M2 : Bayer Crop-Science (2008) M3: Colombo et al. (1998) ? Extracción Cantidad Pureza

  15. MATERIALES Y MÉTODOS Extracción Cuantificación Genotipado • Amplificación (PCR) • Electroforesis (poliacrilamida) • Revelado • Tinción (nitrato de plata) • Fluoresencia (Li-cor 4300S ) Análisis de datos • Frecuencia alélica. • Análisis de agrupamiento. • Análisis multivariado (ACoP). • Análisis de asignación genética.

  16. Nacional CCN-51 M R1 R2 R3 R1 R2 R3 200 ng 120 ng 80 ng 40 ng Nacional CCN-51 M R1 R2 R3 R1 R2 R3 200 ng 120 ng 80 ng 40 ng Nacional CCN-51 M R1 R2 R3 R1 R2 R3 200 ng 120 ng 80 ng 40 ng 20 ng RESULTADOS Y DISCUSIÓN Extracción de ADN a) Doyle & Doyle, 1987 Bandas definidas de ADN Concentración60ng a 200ng b) Bayer Crop-Science, 2008 Bandas definidas de ADN Concentración60ng a 120ng c) Colombo et al., 1998 Bandas poco definidas Concentración20ng a 50ng Figura 1 Geles de agarosa al 1 % con los aislados de ADN de cacao Nacional y CCN-51. a) Doyle & Doyle 1987 b) Bayer Crop-Science, 2008 y c) Colombo et al., 1998. M: marcador Low Mass Ladder. R: repeticiones por grupo.

  17. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Cantidad de ADN Tabla 2 Cantidades promedio de ADN obtenidas en los diferentes protocolos y prueba de comparación de medias (Tukey al 5%). Tabla 3 Cantidades promedio de ADN obtenidas en los diferentes grupos genéticos y prueba de comparación de medias (Tukey al 5%). Figura 2 Concentraciones promedio de ADN influenciados por el método de extracción y el grupo de estudio. • Lípidos Ácidos Grasos (50%) • Carbohidratos • Proteínas • Metabolitos secundarios La semilla es un tejido de reserva • Taninos • Alcaloides • Fenoles • Terpenos Viabilidad de la semilla de cacao recalcitrante Órgano latente < cantidad de núcleos x peso

  18. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Pureza de ADN Tabla 4 Análisis de varianza (ADEVA) para el índice de pureza de ADN. Tabla 5 Índices de pureza promedio de ADN obtenidas en los diferentes protocolos y prueba de comparación de medias (Tukey al 5%). Figura 3Índices de pureza de ADN (Abs260/Abs280) promedios influenciados por el efecto del método de extracción. • El CTAB usado en el primer protocolo es un detergente catiónico a diferencia del SDS • El agente PVP (polyvinilpirrolidona)  precipita los desechos • β-mercaptoetanol proteger el ADN contra la actividad enzimática • Purificación con alta concentración de NaCl • Un componente importante en este proceso fue el nitrógeno líquido

  19. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Método 1 Método 2 Método 3M Nacional CCN-51 Nacional CCN-51 Nacional CCN-51 aaaaaaR1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 Amplificación del ADN aislado M1: Doyle & Doyle (1987) M2 : Bayer Crop-Science (2008) M3 : Colombo et al. (1998) M1: Doyle & Doyle (1987) M2 : Bayer Crop-Science (2008) M3 : Colombo et al. (1998) Figura 2 Productos de amplificación en gel de agarosa al 2 % de las muestras de ADN obtenidas con tres métodos de extracción y probadas con el mTcCIR 58. Aunque los aislados presentaron contaminación y degradación, se pudo amplificar  probablemente se deba a la capacidad de la PCR y de los microsatélites.

  20. mTcCIR 37 – 177 pb * * * * * mTcCIR 12 – 222 pb mTcCIR 37 – 165 pb mTcCIR 12 – 212 pb mTcCIR 37 – 159 pb mTcCIR 12 – 210 pb Fincas de cacao tipo Nacional Fincas de cacao CCN-51 mTcCIR 37 – 151 pb mTcCIR 12 – 204 pb mTcCIR 37 – 147 pb mTcCIR 37 – 143 pb mTcCIR 12 – 187 pb mTcCIR 37 – 139 pb 222pb 212pb 210pb 204pb 199pb 187pb RESULTADOS Y DISCUSIÓN Genotipado Figura 4 Marcador mTcCIR 12 en que se observan 5 alelos y la presencia de sombras y arrastre. *Datos perdidos Figura 3 Amplificación del marcador mTcCIR 37 en que se observan 7 alelos. Se seleccionaron 8 SSR  mTcCIR 7, 11, 12, 15, 24, 33, 37 y 58 Figura 5 Amplificación obtenida con el marcador mTcCIR 12 revelada en el sistema LI-COR 4300 en muestras del tipo Nacional y CCN-51.

  21. Fincas de cacao tipo Nacional Fincas de cacao CCN-51 264pb 258pb 256pb 248pb 236pb 206pb RESULTADOS Y DISCUSIÓN Figura 6 Amplificación obtenida con el marcador mTcCIR 58 revelada en el sistema LI-COR 4300 en muestras del tipo Nacional y CCN-51. Genotipado en geles de poliacrilamida presentaron perfiles poco concisos El LI-COR 4300S  mayor claridad y nitidez Observar la presencia de alelos cercanos (258pb y 256pb)

  22. RESULTADOS Y DISCUSIÓN • Se contabilizaron en total 44 bandas para las 66 muestras  rango (139 y 346 pb). • Dos o más bandas por locus  tipo Nacional • En CCN-51  dos alelos por locus en varios materiales • El loci con > variabilidad fue el mTcCIR 37 (7 alelos) y el < fue el mTcCIR 7 (4 alelos). • Se logró obtener un 100% de amplificación en los mTcCIR 7, 11, 12, 15, 33 y 58. Figura 7 Número de alelos de CCN-51, IMC-67, ICS-95 y de tipo Nacional presentes en las fincas cacaoteras de la zona central de la costa Ecuatoriana.

  23. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Tabla 6 Número de bandas totales y privados para las poblaciones: tipo Nacional, CCN-51 y controles. • Se hallaron 11 alelos específicos para el tipo Nacional. • 33 alelos del tipo Nacional compartidos con las finca de CCN-51 y los controles. • 7 alelos compartidos solo entre las fincas Nacionales y CCN-51 • No se encontraron alelos específicos para CCN-51 Tabla 7 Alelos de CCN-51 registrados con sus frecuencias para cada grupo de cacao

  24. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Análisis de agrupamiento GRUPO A GRUPO B1 GRUPO B 690 Figura 8 Dendograma UPGMA de las 66 muestras de Theobroma cacao L., analizadas con ocho SSRs.

  25. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 6.95 % Análisis de Coordenadas Principales GRUPO B GRUPO B1 7.17% GRUPO A Figura 9 Distribución de las 66 muestras de cacao del tipo Nacional en análisis ACoP.

  26. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Análisis de estructura GRUPO B GRUPO B1 Tabla 8 Análisis de asignación genética cuando K=6 para muestras de semillas de fincas cacaoteras del tipo Nacional. Valores de asignación (q) ≤ a 0.05 no son mostrados, software Structure. GRUPO A Figura 9 Distribución de las 66 muestras de cacao del tipo Nacional en análisis ACoP.

  27. RESULTADOS Y DISCUSIÓN GRUPO B GRUPO B1 GRUPO A Tabla 9 Análisis de asignación genética cuando K=6 para muestras de semillas de fincas cacaoteras CCN-51 y controles. Valores de asignación (q) ≤ a 0.05 no son mostrados, software Structure.

  28. CONCLUSIONES • El protocolo de aislamiento de ADN que proporcionó el resultado más favorable en términos de cantidad y pureza de ADN, fue el desarrollado por Doyle y Doyle (1987) y modificado por Faleiro (2002). • Los ADNs obtenidos mediante los protocolos uno (Doyle & Doyle, 1987 modificado por Faleiro et al., 2002) y dos (Bayer Crop-Science 2008) tuvieron un rendimiento bajo en cantidad y pureza, pero fueron suficientes para llevar a cabo el marcaje molecular por la técnica PCR con marcadores microsatélites. • La baja resolución obtenida en ciertos microsatélites amplificados, en la matriz de poliacrilamida teñida con Nitrato de Plata, se observó mejor con el uso del equipo LI–COR 4300 ya que contribuyó a reducir el error de lectura que se produjo y además permitió la confirmación de bandas y asignación de pesos moleculares.

  29. CONCLUSIONES • En los ocho marcadores microsatélites evaluados, no se encontró alelos específicos para CCN-51, que posibiliten una discriminación inequívoca dentro de los perfiles moleculares del tipo Nacional analizados. • Se hallaron once alelos presentes en el tipo Nacional que no correspondieron a los genotipos control ni a las fincas de cacao CCN-51. En cambio se hallaron dos alelos pertenecientes a CCN-51 (mTcCIR 58 – 236 y mTcCIR 58 – 258) que tuvieron baja frecuencia en las fincas del tipo Nacional. • El análisis molecular determinó que dentro de las 19 muestras de CCN-51 analizadas, son 11 las fincas que cultivan solo el genotipo CCN-51, en el resto a mas de CCN-51 se encuentran presentes otros genotipos.

  30. RECOMENDACIONES • En la extracción de ADN de semillas es necesario implementar ciertas modificaciones para mejorar el rendimiento y la calidad del ADN, para ajustar el proceso y obtener resultados con un alto grado de confiabilidad. • Se debería implementar métodos de purificación, debido a la abundancia de nutrientes de reserva y otras sustancias en las semillas de cacao, para así obtener un aislado de mejores características que garantice una óptima calidad en la amplificación de microsatélites. • Ante los resultados del genotipado obtenido en geles de poliacrilamida, se sugiere el uso del equipo LI - COR 4300, para mejorarlo, ya que este último provee de una mejor resolución del bandaje en un pool de ADN.

  31. RECOMENDACIONES • Se recomienda realizar una nueva búsqueda de marcadores microsatélites con el fin de encontrar variantes alélicas propias de CCN-51 y que se encuentren en bajas frecuencias en el tipo Nacional o en el mejor de los casos alelos únicos. • Se podría incrementar el número de loci de entre 2 y 4 por cromosoma e incrementar el número de muestras del tipo Nacional, para llevar a cabo un trabajo de validación de la técnica a gran escala, lo cual permitirá ampliar la información requerida para establecer los marcadores que permitirán desarrollar la herramienta que permitirá controlar y limitar la ocurrencia de mezcla entre los cacaos del tipo Nacional y CCN-51. CCN-51 Nacional CCN-51

  32. RECOMENDACIONES • Se sugiere tomar en cuenta los 11 alelos registrados en este estudio como propios del tipo Nacional, como una posible estrategia para la discriminación con CCN-51. Además se sugiere que los alelos mTcCIR 58 – 236, mTcCIR 58 – 258 y el mTcCIR 12 – 199, sean considerados en futuros análisis de para evaluar su capacidad de discriminación. • Es recomendable confirmar la procedencia de las muestras que vayan a ser tomadas para futuros estudios encaminados a establecer diferencias genéticas para la discriminación entre CCN-51 y el tipo Nacional, para así limitar la mezcla de CCN-51 en la variedad Nacional durante la evaluación preliminar de la herramienta y evitar erróneas en los análisis. Nacional CCN-51

  33. Escuela Politécnica del Ejército Instituto Nacional Autónomo de Investigaciones Agropecuarias Muchas Gracias

  34. “ El chocolate Ecuatoriano tal vez no sea el mas reconocido pero estoy seguro que puede llegar a ser el mejor del mundo”

  35. CUANTIFICACIONProtocolo 1: Desarrollado por Doyle&Doyle (1987) y modificado por Faleiro (2002) Muestras: 1-6Protocolo 2: Desarrollado por Bayer Crop-Science (2008) Muestras: 7-13 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

  36. Protocolo: Desarrollado por Doyle&Doyle (1987) y modificado por Faleiro (2002) Sin modificaciones Con modificaciones

  37. VALIDACION DE PRIMERS PRIMERS 51 °C

  38. PRIMERS 46 °C

  39. DUPLEX

  40. INTRODUCCIÓN

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