实验二 SDS － PAGE 测定蛋白质相对分子质量

实验二 SDS－PAGE测定蛋白质 相对分子质量

【目的要求】 • 学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。 • 掌握垂直板电泳的操作方法。 • 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。

【实验原理】 • 电泳带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象。 • PAGE 聚丙烯酰胺凝胶（PAG）是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙二胺(TEMED)和催化剂过硫酸铵(AP) 的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。以此凝胶作为支持介质的电泳称为PAGE。 PAGE具有电泳和分子筛的双重作用。

CH2=CH CH2=CH C=O C=O NH CH2 NH C=O NH2 ( )n ( )m CH2-CH CH2-CH CH2-CH CH2¯CH CH2-CH CH2-CH CH2-CH C=O NH CH2 NH C=O C=O CH2=CH C=O C=O C=O NH2 NH2 NH2 NH2 ( )n ( )m CH2-CH CH2-CH CH2-CH 丙烯酰胺 N,N’-甲叉双丙烯酰胺聚丙烯酰胺

PAG机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，改变PAG机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，改变 • Acr浓度或Acr与Bis的比例可以得到不同孔径的凝胶。 • PAGE分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统电泳体系中缓冲液pH值与凝胶中的相同.带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。

【SDS-PAGE基本原理】 • SDS-PAGE是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。 • 强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键破坏蛋白质的四级 • 结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解 • 聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS • 复合物。

有许多蛋白质是由亚基或两条以上肽链组成的，它们在 • SDS和巯基乙醇作用下，解离成亚基或单条肽链，因此 • 这一类蛋白质，测定的只是亚基或单条肽链的MW。 • 蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超 • 过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所 • 带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 • 的相对分子质量。而与其所带电荷的性质无关。

当蛋白质的分子量在17,000～165,000之间时， 蛋白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系： • lgMW = K - bm • 将已知分子量的标准蛋白质在SDS-PAGE中的电泳迁移率对分子量的对数作图，即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。

浓缩效应 SDS-PAGE过程有浓缩效应和分子筛效应 • 浓缩胶（大孔胶） • 浓缩胶缓冲液pH6.7 Tris-HCl, 电极缓冲液pH8.3 Tris-Gly 解离度：Cl> 蛋> Gly mclcl>m蛋蛋>mGlyGly • 凝胶中Cl－为快离子， Gly－为慢离子，蛋白质样品被夹在中间。

浓缩效应 • 样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3) • 蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。

分子筛效应 • 蛋白质样品进入分离胶（小孔胶）后pH增大(pH 8.9 Tris-HC1)，Gly－解离度增大，不存在快、慢离子之分，蛋白质样品在均一电场强度和pH条件下泳动。 • 由于各种蛋白质分子量不同，因此质点的有效迁移率不同，形成不同区带。

分子筛效应 • 分离胶的孔径小，各分子由于大小和形状不同，所受阻力不同，表现出不同的泳动速度，即分子筛作用。分子量小，形状为球形的泳动速度最快。

【操作方法】 １、安装夹心式垂直板电泳槽 1)装上贮槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上。 2)将长、短玻璃板分别插到凵形硅橡框的凹形槽中，注意勿用手接触灌胶面的玻璃。 3)将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。 4)将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手对角线的方式旋紧螺丝帽。 5)竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙加入已融化的1%琼脂。其目的是封住空隙，凝固后的琼脂中应避免有气泡。

2、凝胶的制备 1）分离胶的制备（按表3-2配制10%的分离胶）将制备的分离胶溶液，加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm。用1 mL注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸水,用于隔绝空气，使胶面平整。约30-60 min凝胶完全聚合.将贮槽的蒸馏水倒去，用细条滤纸吸去残留的水液。

2）浓缩胶的制备（按表3-2配制3%的浓缩胶） 将制备的浓缩胶溶液加到长、短玻璃板的窄缝内，距短玻璃上缘0.5cm，然后插入样品槽模板.在上、下贮槽中加入蒸馏水，但不能超过短玻璃板上缘。静置30 min左右，上胶即可聚合，再放置10-20 min，放出蒸馏水，加入电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.5cm，轻轻取出样品槽模板，即可加样。

3、蛋白质样品的处理 1）标准蛋白质样品的处理低分子量标准蛋白试剂盒:兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白 MW=66,200 牛碳酸酐酶 MW=31,000胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400开封后溶于200µl样品溶解液中，沸水浴中加热3- 5min后上样。

2）待测样品处理 a)称1、2、3号待测样品各1mg，按1mg/mL溶液比例加样品溶解液，将其转移到带塞的小离心管中，轻轻盖上盖子，在沸水浴中加热3min，取出冷却后加样。 b)称制备样品1mg，按1mg/mL溶液比例加样品溶解液，将其转移到带塞的小离心管中，轻轻盖上盖子在沸水浴中加热3min，取出冷却后加样。

将电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接，打开电泳仪开关，开始时电流为10 mA，待样品进入分离胶后，将电流调至20-30 mA，当溴酚蓝染料距硅胶框1cm时，停止电泳，关闭电源。 4、加样用移液器分别取10 l样品液，小心将样品加到凝胶凹形样品槽底部。并做好标记。 5、电泳

Staking gel Separating gel

7、结果处理 6、染色与脱色电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅胶框，用不锈钢药铲撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。加入染色液染色1-2 h，再用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。量出加样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离(cm)，按下式计算相对迁移率mR：相对迁移率mR= 蛋白质样品迁移距离(cm) 溴酚蓝区带距加样端距离(cm)

撬开短玻璃板

【注意事项】 1）安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝，避免缓冲液渗漏。 2）用琼脂封底及灌胶时不能有气泡，以免电泳时影响电流的通过。 3）加样时样品不能超出凹形样品槽。加样槽中不能有气泡，如有气泡，可用注射器针头挑除。

【思考题】 1、在样品溶解液中SDS、巯基乙醇、甘油及溴酚兰的作用分别是什么？ 2、电极缓冲液中甘氨酸的作用? 3、在SDS-PAGE中,分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP,试述其作用? 4、样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟?

实验二 SDS － PAGE 测定蛋白质相对分子质量