Single Chromatin Stre t ching Reveals Physically Distinct Population of Dis as sembly Events

1. Single Chromatin Stretching Reveals Physically Distinct Population of Disassembly Events L. H. Pope, M. L. Bennink, K. A. van Leijenhorst-Groener, D. Nikova, J. Greve, und J. F. Marko wird präsentiert von Anil Demirata

2. Gliederung • Hintergrundwissen und Einführung • Material und Methoden • Ergebnisse und Diskussion • Zusammenfassung und Ausblick

3. Grundkenntisse • DNA + Proteine  Chromatin • Kompaktierung: 104 – 105 • Grundeinheit: Nukleosom • Es besteht aus: • NCP: nucleosome core particle • Linkerhistonen • Linker DNA • Höher geordnete Chromatin Strukturen http://micro.magnet.fsu.edu/cells/nucleus/images/chromatinstructurefigure1.jpg

4. Nukleosom • NCP: ist ein Oktamer • 1x (H3-H4)2 Tetramer • 2x (H2A-H2B) Dimere • DNA: ~146 bp • um 1,65 mal • Linkerhiston: bindet ein/ausgehende DNA(~160bp) • Linker DNA: Abstandhalter: (~200bp) • Chromatin Breite:11 nm http://www.mun.ca/biochem/courses/3107/images/Stryer/Stryer_F37-08.jpg http://www.bio.miami.edu/dana/104/nucleosome.jpg

5. Höher geordnete Chromatin Strukturen • Auch 30 nm-Fiber genannt • Zwei Modelle • Reguläre Spirale • Irregulärer Zick Zack • Aktive Form • Dynamisch für • Rekombination • Transkription • Reparationsmaschinerie http://edoc.hu-berlin.de/dissertationen/seitz-stefanie-2004-10-20/HTML/seitz_html_21996ee1.png

6. wird erreicht durch... • Posttranslationale Modifikationen an den Ausläufern von Histonen: • acetyliert (A) • phosphoryliert (P) • Ändert NCP-NCP Wechselwirkung (WW) •  der Grad der Kompaktierung ist regulierbar durch Schlüsselenzyme http://chemistry.gsu.edu/faculty/Zheng/nucleosome.jpg

7. wird erreicht durch (2)... • Änderungen in Ionenkonzentrationen • Linkerhistone • die Abschirmung der negativen Ladung des DNA-Rückgrats • auch durch basische nicht-Histon Proteine: HMGs • Polyamine in Chromatin http://academic.brooklyn.cuny.edu/biology/bio4fv/page/molecular%20biology/dsDNA.jpg

8. Einführung • Vorteil der Forschung mit einzelnen Molekülen • Untersucht werden • Struktur, • Dynamik, • Kinetik und • Mechanik • von DNA-Protein WW • in Zusammenhang mit DNA-Kompaktierung • mit den Methoden: AFM, Optical Tweezer und flow generated forces

9. Extrahierte individuelle Chromatinfäden Native Chromatinfäden Untersucht wird mechanische Eigenschaften Bei verschiedenen Salzkonzentrationen Weniger kompaktes Chromatin in niedrigeren Salzkonzentrationen Rekonstruierte Chromatinfäden präzis und reproduzierbar Strukturelle Informationen Stretching Zerreißen von einzelnen Nukleosomen drei wichtige Studien • Individuelle DNA Moleküle • Definierte kurze Nukleosomenarray • Keine Linkerhistone • Nukleosomen werden schrittweise gespaltet

10. Ziel dieser Arbeit • Bestehende Frage: “Wie wird der genetische Code organisiert und zugegriffen?” • Erwartungen: Die Stretching-Bedingungen beeinflussen Zerreißkraft • Hier: bestimmt wird • Zerreißkraft (F) und • Längenunterschied (ΔL) • jeweils pro mechanisches Zerreißen von Chromatinfaden (Event) • Zerreißkraft  Energiebarrieren • Längenunterschied  Typ des Nukleosomsunterbrechen

11. Ziel dieser Arbeit (2) • Bestehende Frage: “Wie wird der genetische Code organisiert und zugegriffen?” • Überlegung: DNA-Protein WW müssen irgendwie geändert und/oder unterbrochen werden • Durch Kraftgenerierende Motoren: Polymerasen

12. Material • 12 bp Überhänge von λ-DNA werden ergänzt • in der PCR mit bio-11-dUTP und bio-14-dATP • Streptavidin bekleidete Polystyrene beads (Ø=2,6μm)

13. Methode • 1 DNA Molekül zwischen 2 Beads • + Xenopus Oozytenextrakt • Kompaktion von DNA von 16,4 μm zu 2 μm

14. Optical trapping • 1064 nm Infrarotlaser • O Micropipette: erlaubt das Bewegen von nicht “getrappten” bead • piezzo-Streckung Optical trapping • Quadrant Detektor: notiert Ablenkung des transmittierten Laserlichts • Kraft ist Direkt proportional zu Δx

15. Ergebnisse • Vergrößerung: • Einzelne Events (DNA-Protein WW) • ΔL  Indiz: welche WW ist unterbrochen(später) • Hier: Dabei steigt die Kraft F steigt stetig an und dann fällt plötzlich ab Fig2 • Genereller Verlauf: • 1.& 2. Streckung von rekonstutierter Chromatinfaden • Kraft / Extensions-Kurve • Plateau bei 65pN(wie bei nackten DNA)

16. Statistik • Kraft-Extensions-Kurven • mit verschiedenen Chromatinfasern • Mit verscheidenen Piezo-Streckgeschwindigkeiten • Zerreißkraft (F) und Längenunterschied (ΔL)

17. Analyse • ΔL pro Event • Histogramme • Multi Gauss Fitting  • 3 peaks bei 30, 59, und 117 nm • 30nm  Abwickeln halbes Nukleosoms • 59nm und 117nm  1-2 Nukleosom Abwickeln

18. Fig 3

19. Applied Dynamic Force Spectroscopy Theory • Betrachtungen: • Für jedes Zerreißen: dF/dt aus • dF/dx und Streckgeschwindigkeit v • Chromatin: Kette von N in Serie geschalteten Ereignissen • folgende Strecken: weniger Ereignisse mit höherer Kraft sichtbar • 3 Energiebarrieren

20. Fig 4 ErstesStrecken Alle WeitereStrecken

21. Korrelationen • Um eine Korrelation zwischen Energiebarrieren und Typ von Zerreißen der Nukleosome zu bestimmen • Daten (F) werden sortiert • Für korrespondierende Energiebarrieren • Graphen F vs ΔL • Eine kleine Korrelation sichtbar

22. Fig5 28 kBT 25 kBT

23. Diskussion • Chromatin DNA + Xenopus Oozytenextrakt • Hier: statt somatischem Linkerhiston H1  embryonisches Linkerhiston B4 • Weniger basisch im C-Terminus • geöffnete aktive Form • in vitro : physiologisch angeordnete Nuckleosomen (mit 62 nm Abstand) • Längenunterschied korreliert nur mit Abwicklung der Nukleosomen

24. Warum zwei verteilte Kräfte?Warum verschwindet eine nach der ersten Strecken? • schrittweise • 1. B4  sehr mobile, schwach gebundene Proteine • 2. H2A-H2B Dimere • 3. (H3-H4)2 Tetramer • Höhere Kraft • im ersten Strecken: alle Linkerhistone • eine Energiebarriere (28kBT) • Niedrige Kräfte • 2 Energiebarrieren (25kBT & 20kBT) • gleiche Anzahl von Events für hohe und niedrige Kraft • in Natur 28kBT und 25kBT Barrieren möglich • Differenz: 3kBT: Energiebeitrag von B4

25. Abwicklung von DNA • 60 nm: ganzes Nukleosom • 30 nm:partielle Abwicklung • 3 Modelle • ändert die Konturlänge • zwei diskräte ΔL: bei 30nm und 60nm

26. neues Modell • zuerst: Linkerhiston und schwachgebunde Teile der NCP • dann: übrige Oktamere • zuerst: Linkerhistone und (H2A-H2B) Dimer • dann: übriges Hexamer K. Klenin, T. Wocjan, J. Langowski (2006) K. Klenin, T. Wocjan, J. Langowski (2006) zweites Modell

27. zusätzlich • Zuerst Chromatinfaden vollständig strecken (bis auf nackte DNA-Länge) • dann Relaxation, Chromatinfaden zieht sich auf intermediäre Konturlänge zusammen •  NCP-Teile nicht vollständing abgelöst • keine Korrelation in der Abfolge der 30nm und 60 nm-Schritte

28. Zusammenfassung • Abwicklung von Nukleosomen verläuft in Schritten • 30 nm “Halbschritte” in rekonstutiertem Chromatinfaden (hier) und kurzen Nukleosomenarrays (Brower-Toland et al.) • 3 Energiebarrieren • Für folgende Streckzyklen: Events zu 28kBT • Energiebeitrag des B4 Linkerhistons: 3kBT

29. Zusammenfassung 2 • diese Barrieren  Hindernis beim Zugriff auf den genetischen Code • kraftausübende Motoren (Polymerasen) • Torsionkräfte auf DNA durch Polymerasen können zum Öffnen des Chromatins beitragen • Nukleosomen können abgewickelt und dann wieder hergestellt werden. • Traskription ist bei (H3-H4)2 nicht gestört

30. Ausblick • Ersetzen oder Ausnehmen von Faktoren im Extrakt • B4 gegen H1 tauschen oder “abschalten” • Rekombinante Histone •  Effekte von (A) & (P) vortäuschen • Histone ohne Ausläufer(tails) • Effekt von HMGs? • Studien mit einzelnen Molekülen: erweitert den Einblick

31. Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit • Fragen?? • Anregungen?? • Beschwerden??