Ereditarietà X-Linked

1. Ereditarietà X-Linked Padre Madre X X X Y Figlia Figlio

2. Regione pseudo-autosomica Cromosoma X Cromosoma Y Geni sottoposti ad inattivazione Geni attivi X Inactive SpecificTranscript Xq13 • circa 80 geni • SRY • Geni della • spermatogenesi circa 870 geni

4. Cromosoma Y Delezioni interstiziali dell’Y nel 5-10% dei soggetti con azoospermia o grave oligospermia non ostruttiva

5. Delezioni del cromosoma Y • Le microdelezioni del cromosoma Y rappresentano una causa importante di sterilità maschile con oligo- azoospermia e la loro identificazione • fornisce un corretto inquadramento diagnostico • permette di evitare trattamenti empirici costosi e inutili • ha importanti conseguenze etiche se il paziente è candidato per le tecniche di riproduzione assistita almeno 3 regioni importanti per la spermatogenesi

6. Casi di azoospermia o oligospermia severa : il 5-10% è portatore di anomalie citogenetiche del cromosoma Y il 5-10% è portatore di delezioni sub-microscopiche di Yq NON sono individuabili all’analisi del cariotipo(microdelezioni) ma possono essere identificate mediante STS-PCR STS “sequence tagged sites”sono sequenze note di DNA genomico che possono essere amplificate tramite PCR

7. Int J of andrology (1999) – Hum Reprod (2001) • Laboratory guidelines for molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletions • M.Simoni et al. • elenco di STS da non utilizzare • set di STS primers consigliati: • AZFa: sY84,sY86 • AZFb: sY127,sY134 • AZFc: sY254,sY255 • Se viene trovata una delezione per valutare la esatta estensione si consiglia l’uso di altri STS che si trovino all’estremità prossimale e distale della regione (particolarmente importante per AZFa e b in pazienti candidati all’ICSI)

8. Multiplex a sY254 (c) sY 86 (a) sY127 (b)

9. Multiplex b sY84 (a) sY134 (b) sY255 (c)

10. Frequenza delle microdelezioni Y estema variabilità tra i vari studi (1%-55%) dipende dai criteri di selezione pazienti azoospermici o gravemente oligospermici (<5 milioni spermatozoi/ml) la percentuale è dell’11% (solo le forme idiopatiche : 18%) se si considerano pazienti con più di 5 milioni di spermatozoi/ml la percentuale è inferiore all’1% Casistica laboratorio Genetica Medica: 1/600 AZFa 2/600 AZFb 12/600 AZFc 6/600 AZFb+c 2/600 AZFa+b+cTot. 23/600 (3.8%)

11. Mutazioni puntiformi in USP9Y* in 2 maschi con ipospermatogenesi

12. Variabilità fenotipica delle delezioni • non costante correlazione genotipo-fenotipo • in genere: • azoospermia (84%) • grave oligospermia (meno di 1 x106ml) (14%) • moderata oligospermia (1-5 x106ml) (2%) • alterazione della spermatogenesi variabile anche in delezioni apparentemente simili • del Y anche in azoo- oligospermici con criptorchidismo o varicocele grave • del Y può promuovere la perdita del cromosoma con mosaicismo somatico 45X / 46XY • del Y molto centromeriche associate a bassa statura

13. Sex reversal

14. Inattivazione dell’X solo uno dei due crom. X è attivo nelle femmine meno di 100 cellule propagazione clonale Zigote femminile casuale innattivazione X pat. / X mat. stadio di morula

15. Inattivazione bilanciata dell’XCosa succede se una donna porta un gene non funzionante sull’X gene mutato Zigote femminile Innattivazione casuale X paterno / X materno il 50% delle cellule non esprime quel gene

16. Inattivazione dell’X • Compensa le differenze di “dose genica” tra maschi e femmine • Alcuni geni sfuggono all’inattivazione (regioni pseudo-autosomiche alle estremità del cromosoma X) • I geni XIST-TSIX in Xq13 sono essenziali per l’inattivazione • La metilazione è uno dei meccanismi dell’inattivazione

17. Inattivazione sbilanciata dell’XPerchè ? • Un cromosoma X porta una mutazione LETALE • C’è una traslocazione bilanciata X ; autosoma • La regione che controlla l’inattivazione è alterata • E’ avvenuto “per caso”

18. Inattivazione Sbilanciata dell’X:effetto della selezione gene mutato Zigote femminile Selezione nei tessuti in cui la funzione del gene è indispensabile Inattivazione casuale stadio embrionale

19. Malattie X-Linked recessive Madre ( portatrice ) Padre X X X Y Femmina Femmina Maschio Maschio SANA PORTATRICE MALATO SANO

20. Ereditarietà X-Linked recessiva

21. Ereditarietà X-Linked recessiva

22. Giorgio Ester Enrico Distrofia Musculare di Duchenne DMD

23. Giorgio ha 3 anni • modesto ritardo nell’iniziare a camminare • cammina con lentezza • ha difficoltà a stare eretto • non corre • all’esame obiettivo • ipertrofia dei gastrocnemi • debolezza dei muscoli prossimali • Creatina Kinasi (CPK) = 10,000 ui

24. Biopsia Muscolare Controllo Normale Giorgio

25. Colorazione Ab anti-Distrofina Controllo Normale Giorgio

26. Distrofina proteina associata alla membrana : - il dominio N-terminale lega l’actina - lungo dominio con 24 ripetizioni omologhe ad α-elica- una regione vicina al C-terminale ricca di cisteine che lega il calcio - il dominio C-terminale che lega altre proteine di membrana

27. Gene DMD 2,4 Mb (12 cMorgan) 8 promotori 79 esoni (0.6%) mRNA 14 kb trascritto in 16 ore DM Duchenne : mancata espressione di distrofina - delezioni molto grandi (65-70%) , duplicazioni (10%) - mutazioni frameshift (10%), stop codon (5%) - delezione “in-frame” con perdita delle regioni C-terminale o N-terminale (domini che legano le proteine) DM Becker : alterata qualità o quantità di distrofina - delezioni “in-frame” (85%) - di cui il 46% nella regione dei “spectrin repeats”

28. Ricerca diretta delle delezioni nella DMD • - preparazione del DNA genomico • - amplificazione con PCR multiplex • di 9 o più esoni • separazione dei frammenti in • gel di agarosio • visualizzazione con EB e raggi UV • - fotografia (o immagine digitale)

29. Giorgio è affetto da Distrofia Musculare di Duchenne • Diagnosi confermata da biopsia muscolare • Il test genetico non ha evidenziato delezioni ( delezioni-dupl. sono presenti nel 70% dei malati ) • Giorgio ha probabilmente una mutazione puntiforme Malattia X-linked recessiva - incidenza di 1 / 3300 tasso di nuove mutazioni di 10-4 / meiosi (1/3 dei casi)

30. Albero famigliare allargatodopo colloqui con la cugina Rosa e la zia Giovanna Elena Giovanna Enrico Ester Giorgio Rosa

31. La cugina Rosavuol sapere che rischio ha di avere un figlio malato • Osservando la famiglia, la probabilità che Rosa sia portatrice è = 25% • Ancor prima del test genetico, si può migliorare la stima del rischio ?

32. Creatina Kinasi (CPK) • fuoriesce dalle membrane del muscolo danneggiato • molto elevata nei maschi malati • livelli elevati solo in 2/3 delle portatrici • Giovanna e Rosa hanno CPK normale

33. Stima “Bayesiana” del rischio Probabilità “complessiva “ : tiene conto della probabilita a priori di essere e di non essere portatore ( appartenendo ad dato albero famigliare ) e di altri fattori che modificano queste due probabilità (prob. condizionali)

34. Giovanna Elena CPK normale Enrico Ester Giorgio RosaCPK normale Zia Giovanna : ha CPK normale e due figli maschi sani

35. Che lo sia Che non lo sia Probabilità “ a priori ” 1/21/2 con CPK Normale ? 1/3 1 con 2 figli Maschi Sani ? 1/4 1 Prob. condizionale 1/2.1/3.1/4 =1/241/2 Prob. finale1 : 12 Quale è la probabilitàche Zia Giovanna sia portatrice ? 1/24 1/24 + 1/2 = 1/13

36. Cugina Rosa : ha 1/2 della probabilità di Giovanna e CPK normale Giovanna Elena CPK normale Enrico Ester Giorgio RosaCPK normale

37. Il rischio a priori per Rosaèla metà di quello di Zia Giovanna 1/13 x 1/2 = 1/26

38. Che lo sia Che non lo sia Probabilità “ a priori ” 1/13 .1/2=1/2625/26 con CPK Normale ? 1/3 1 Prob. “ a posteriori ” 1/26.1/3 =1/78 25/26 Prob. finale1 : 75 Quale è la probabilitàche Rosa sia portatrice ? Che lo sia Che non lo sia Probabilità “ a priori ” 1/13 .1/2=1/2625/26 con CPK Normale ? 1/3 1 Prob. “ a posteriori ” 1/26.1/3 =1/78 25/26 Prob. finale1 : 75 1/78 1/78+25/26 = 1/76

39. Probabilità che Rosa possa avere un figlio affetto 1/ 76 x 1/4 = 1 / 304 Prob. di essere portatrice X rischio di trasmissione

40. 1/304 è la probabilità che la cugina Rosapossa avere un figlio affetto Giovanna Elena CPK normale (1/13) Enrico Ester Giorgio RosaCPK normale (1/76)

41. Uso del Linkage nella malattia DMD ( mutazione non trovata ) Giovanna Elena Enrico Ester Giorgio Rosa

42. Analisi di linkage • Linkage = concatenazione • Alleli corrispondenti a loci tra loro vicini sullo stesso cromosoma tendono ad essere trasmessi insieme (come una singola unità) durante la meiosi Allele 2 Gene wt Allele 1 Allele 1 locus polimorfico A (1, 2, 3, 4) Gene con mutazione Allele 3 locus polimorfico B (1, 2, 3, 4, 5)

43. Analisi di linkage 1 Mut 3 2 wt 1 • La frequenza di ricombinazione • è una “misura della distanza” • tra loci diversi : • = 0.5 (50%) loci lontani • = 0 (0%) loci vicinissimi • = 0.02 (2%) loci vicini unità di misura = centiMorgan cM = 1 ricombinazione/100 meiosi 2 Mut 3 1 wt 1

44. Esone 79 Esone 1 Esempio di marcatori polimorfici impiegati nel linkage della DMD2,4 Mb (12 cMorgan) 3’ Microsatellite D: 1, 2, 3, .... 6 alleli Microsatellite C G E N E DMD Microsatellite B Microsatellite A: 1, 2, 3, ..... 10 alleli 5’

45. Uso del Linkage: 1 marcatore(A) 5’ UT Giovanna Elena 7 1 3 7 1 Enrico Ester Giorgio Rosa 1 7 3 ( e se ci fosse una ricombinazione tra mut. e marcatore? )

46. Giovanna Elena 5 4 6 5 4 7 1 3 7 1 Enrico Ester Giorgio Rosa 4 5 6 1 7 3 Uso del Linkage: 2 marcatori(A + D) ( c’è stata ricombinazione tra mut. e marcatore ? )

47. Uso del Linkage: 2 marcatori(A + D) Sarà stata trasmessa la mutazione ad Ester ? Giovanna Elena 5 4 6 5 4 2 7 1 3 7 1 9 Enrico Ester Giorgio Rosa 4 5 6 2 4 1 7 3 9 7

48. 1 1 mut mut mut 1 2 mut mut mut 1 e 2 ricombinazioni tra marcatori

49. Esone 79 Esone 1 Esempio di marcatori polimorfici impiegati nel linkage della DMD2,4 Mb (12 cMorgan) 3’ Microsatellite D: 1, 2, 3, .... 6 alleli Microsatellite C 0.124 = 0.0002 4 ricombinazioni in 1 su 5000 casi G E N E DMD Microsatellite B Microsatellite A: 1, 2, 3, ..... 10 alleli 5’

50. Nuove mutazioni 10-4 / meiosi (1/3 dei casi) 4 4 1 1 Se il marito di Rosa avesse un aplotipo 4-1 ?? Giovanna Elena 5 4 6 5 4 7 1 3 7 1 Enrico Ester Giorgio Rosa 5 6 4 7 3 1