Griezto preparātu sagatavošana

1. Griezto preparātu sagatavošana Šūnu bioloģijas metodes Tūrs Selga

2. Saldējamais galdiņš 1. – slēdzis, 2. – saldējamais galdiņš, 3. – ien’qakošā ūdens caurulīte, 4. – izejošā ūdens caurulīte, 5. – piederumi griezumu pārnešanai (pincetei ir asi un līki gali!)

3. Ledus piramīdas a b a – pareizi sagatavota ledus piramīda, b – nepareizi sagatavota ledus piramīda

4. Augu audi sagriezti uz saldējamā galdiņa • skalo paraugus 5 min • piesūcina paraugus ar 20% saharozes šķīdumu vismaz 15 min • sagatavo darbam saldējamo galdiņu: • pievieno pie krāna dzesēšanas sistēmu un atgriež krānu • ieslēdz saldējamo galdiņu • pēc 3 min uzpilina ūdens pilienu • uz piliena novieto paraugu • paraugu pārsedz ar sīkiem ūdens pilieniņiem un tos sasaldē • ar atdzesētu žileti sagriež paraugu • ar preparējamo adatu, pinceti vai žileti pārnes griezumus uz priekšmetstiklu ūdens pilienā • izslēdz saldējamo galdiņu

5. Parafīna bloku sagatavošana • Saloca 2 papīra veidņus un tos ievieto statīvā; • Katru no veidņiem līdzpusei piepilda ar parafīnu no porcelāna tīģeļa; • Nedaudz atdzesē līdz daļējai parafīna sacietēšanai veidnī; • Ar pinceti izņem paraugus un novieto uz sacietējušā parafīna; • Pārlej paraugus ar atlikušo parafīnu; • Uz 15 min statīvu ar paraugiem ievieto ledusskapī. NB nedrīkst pieļaut parafīna kristalizāciju tīģelī!

6. Parafīna bloku sagatavošana

7. Koka paliknīšus ievieto termostatā un sasilda; • Izņem sastingušo veidni un ar žileti izgriež bloku; • Siltam koka paliknītim uzpilina šķidru parafīnu; • Ar sveci uzkarsē parafīna bloka apakšējo daļu un piestiprina pie paliknīša; • Ar žileti apgriež bloka augšējo daļu piramīdas formā tā, lai līdz objektam paliktu apmēram 1mm.

8. Parafīna bloku ievietošana mikrotomā un griešana

9. Griešana ar rotējošo mikrotomu • Bloku klucīša vietā iestiprina mikrotomā; • Griež līdz parādās griezumi ar paraugu; • Novieto zem mikrotoma priekšmetstikliņu un turpina griešanu, līdz sakrājas 4-5 griezumi; • Ja griezumi paliek uz naža, tad tos noņem ar smalku otiņu un pārnes uz priekšmetstikliņa. Parafīna griezums

10. Griešana ar ultramikrotomu • Bloku iestiprina mikrotoma paraugu turētāja; • Ievieto stikla nazi un piepilda ar ūdeni; • Griež 20-30 mikrometru biezus griezumus; • Griezumus noņem ar smalku otiņu, vai pārlej kopā ar ūdeni no naža vanniņas uz priekšmetstiklu.

11. Priekšmetstikliņu sasilda uz spirta lampiņas līdz sāk kust griezumu parafīns; • Pilinot paraugus pārsedz ar ksilolu un uz 5 min ievieto kamerā; • Atsūc ar filtrpapīru šķīdumu; • Pilinot paraugus pārsedz ar etanolu 96% un uz 10 min ievieto kamerā; • Atsūc ar filtrpapīru šķīdumu; • Pilinot paraugus pārsedz ar etanolu 70% un uz 10 min ievieto kamerā; • Atsūc ar filtrpapīru šķīdumu; • Uzpilina ūdeni uz 5 min.

12. Parafīna griezumuapstrāde uz priekšmetstikliņa

13. Paraugu krāsošana • Krāsošana hemotoksilīna (B krāsa) šķīdumā 2 min; • Skalošana destilētā ūdenī 2 reizes 5 min; • Krāsošana eozīna (A krāsa) šķīdumā 2 min; • Skalošana destilētā ūdenī 2 reizes 5 min. Griezumuapstrāde uz priekšmetstikliņa

14. Pastāvīgo preparātu sagatavošana • Atūdeņo paraugus uzpilinot 30% - 10min, 70% - 10 min, 96% -2x5 min.; • Paraugam uzpilina 1 pilienu glicerīna; • Pārsedz ar segstikliņu un segstikliņa malas nolako ar nagu laku.

15. Pastāvīgais preparāts

16. Preparāta kvalitātes novērtējums • Vai griezums ir vienādā biezumā? • Vai visas griezuma daļas nokrāsotas līdzīgi? • Vai redzama objekta anatomiskā uzbūve, audu izvietojums? • Vai šūnas ir saplēstas? • Vai parauga detaļas ir piemērotas fotografēšanai? • Nosauciet 3 iespējamos uzlabojumus griešanas, paraugu pārnešanas un krāsošanas procesā.

17. Gadu vecs glicerīnā uzglabāts pastāvīgais preparāts. Mainās parauga krāsojums.