1 / 30

Konfokální mikroskop confocal laser scanning microscope (CLSM)

Konfokální mikroskop confocal laser scanning microscope (CLSM). Historie. Minský M. (60. léta 20. století) Petráň M. a Hadravský M. (1967) - konstrukce konfokálního mikroskopu pracujícího na bázi rotace Nipkowova kotouče

nigel-white
Download Presentation

Konfokální mikroskop confocal laser scanning microscope (CLSM)

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Konfokální mikroskop confocal laser scanning microscope (CLSM)

  2. Historie • Minský M. (60. léta 20. století) • Petráň M. a Hadravský M.(1967) - konstrukce konfokálního mikroskopu pracujícího na bázi rotace Nipkowova kotouče • rozvoj od konce 70. let 20. století - laserový paprsek, počítač • dvou (multi-) fotonový mikroskop

  3. Confocal - conjugate (sbíhat) + focal (ohniskový) obě clonky jsou umístěny v ohniscích Laser Scanning Microscop (internet)

  4. informace o intenzitě světla detektor světla konfokální bodová clonka informace o souřadnicích bodů (X - Y) dělič paprsků a rastrovací zařízení laser zrcadlová bodová clonka objektiv objekt zaostřená rovina Schéma současného konfokálního mikroskopu (s rozmítaným laserovým paprskem) (Vesmír, 1995)

  5. Princip konfokálního mikroskopu konfokální clonka paprsky z ohniskové roviny ohnisková rovina paprsky z mimoohniskových rovin čočka mimoohniskové roviny

  6. Konfokální mikroskop na bázi Nipkowova kotouče světlo série čoček dichroické zrcátko CCD Nipkowovy kotouče série otvorů rotace objektiv objekt (internet)

  7. 1 2 3 4 řez 3 řez 4 řez 2 řez 1

  8. řez 4 řez 3 řez 1 řez 2

  9. Využití světla pro CLSM • reflexe - textura a složení povrchů - elektronických součástek, studium neuronových sítí (pomocí Ag), … • difúze • fluorescence - struktura buňky a tkání, studium metabolických drah, ...

  10. Výhody CLSM • odstranění mimoohniskových rovin • vysoký kontrast obrazu • neinvazní metoda • zachování prostorového uspořádání • schopnost vytvoření prostorové rekonstrukce • digitální forma výstupu - rotace, perspektiva, ... • schopnost zobrazení buňky - tkáně - mnohobuněčného organismu • současné použití až 4 kanálů + procházející světlo

  11. Nevýhody CLSM • délka zpracování materiálu i snímků =>,,vyhasínání fluorescence” • neostré snímky při nízké intenzitě fluorescence • pořizovací cena (mikroskop, konfokální nástavec, počítač + program)

  12. snímek z digitálního fotoaparátu snímek z konfokálního mikroskopu

  13. Srovnání 3 metod užívaných ve fluorescenční mikroskopii laser laser rtuťová výbojka optický řez (0,5-2µm) 2-fotonová fluorescenční konfokální excitační světlo oblast excitace ( „vyhasínání“) pozorovaná oblast (Lacey, 1999)

  14. (Olympus)

  15. Dvoufotonová mikroskopie • absorbce 2 fotonů fluorochromem ve stejném okamžiku => záření s dvojnásobnou vlnovou délkou (poloviční energie) => excitační záření 700 nm (červená) => emitované záření 900 nm

  16. Výhody • se zvyšující se intenzitou záření zdroje se zvyšuje pravděpodobnost absorpce 2 fotonů fluorochromem • excitace fluorochromu jen v zaostřené rovině => odpadá nutnost konfokální clonky => maximum světla • velká vlnová délka (700 nm)=> pomalejší „vyhasínání“ • menší rozptyl světla ve vzorku • větší penetrace světla ve vzorku • malá fototoxicita (x UV záření) Nevýhody • cena Ti Sapphire laseru • ohřev vzorku => užití laserových pulsů než plynulé ozáření

  17. oblast excitace pozorovaná oblast Srovnání konfokální a 2-fotonové mikroskopie 2-fotonové konfokální (internet)

  18. FV 500 LSM 5 LIVE DIGITAL ECLIPSE C1 TCS SP2 Konfokální mikroskopy

  19. Olympus Fluoview 500 • optické řezy v rovinách XY, XYZ , XZY • schopnost zaznamenat změny i v časové rovině XYt,XYZt • současné snímání obrazu v procházejícím a fluorescenčním světle • použití 4 kanálů zároveň • sekvenční snímání • volitelnost rychlosti a typu rastrování => kvalita snímku • kompenzace šumu, zesíleni signálu • 3D rekonstrukce obrazu a rotace

  20. vazba aktin-faloidin (FITC)

  21. vazba aktin-faloidin (FITC)

  22. vazba aktin-faloidin (TRITC)

  23. vazba tubulin-protilátka (FITC)

  24. vazba aktin-faloidin (FITC) vazba DNA-DAPI

  25. vazba aktin-faloidin (FITC) vazba DNA-DAPI vazba mitochondrie-mitotracker red neuron, vazba mikrotubulové proteiny- protilátka (Texas-RED)

  26. autofluorescence

  27. fluorescence Gomoriho trichromu

  28. Internetové odkazy http://137.120.28.214/cslm/lpath.mpg http://www.microscopyu.com/articles/confocal/index.html http://www.olympusmicro.com/primer/virtual/confocal/index.html http://micro.magnet.fsu.edu/primer/java/multiphoton/excitationbleaching/index.html http://www.olympusmicro.com/primer/java/confocal/index.html http://www.microscopyu.com/galleries/confocal/index.html http://www.lob.polytechnique.fr/themes/imagerie_fonctionnelle/Anim_cell1_small.gif

More Related