centrifugation at 105,000 g for 1h endonuclease

1. washing with low salt buffer urea (7 M), thiourea (2M), CHAPS (4% w/v) DTT (15 mM) protease inhibitor cocktail or Tris (40 mM) GSH (1 mM) EDTA (0.5 Mm) protease inhibitor cocktail grounded mechanically under liquid nitrogen passing through a syringe needle sonication Dounce homogenization Serum FFE 1500V, 25 mA, ~33 min max. 70 fractions (pH 2.5~11) 1D PAGE Cultured animal cell line Tissue, E. Coli, yeast.. centrifugation at 105,000 g for 1h endonuclease Diluted with separation media final protein concentration of 0.5~6.0 mg/ml

2. FEE sample running • 샘플은 1.0~6.0 mg protein 으로 건조되어있는 상태이거나 low salt buffer 에 녹여있는 상태이어야 하며 샘플 당 전체 volume이 0.1 ml 을 넘지 않도록 해야 합니다. • 최대 5개 sample 까지 한번에 running 가능하며, sample이 예를 들어 7개인경우에는 2개, 5개 로 나눠 맡기셔야 합니다. 같은 종류의 샘플도 0.1 ml 또는 전체 단백질량이 6 mg 을 넘을 경우 에는 두개의 샘플로 간주됩니다. 자세한 조건은 샘플 의뢰 전에 문의하시기 바랍니다. • Serum 은 전 처리없이 그냥 가져오시면 됩니다. • 모든 샘플은 urea 가 있을 때와 없을 때 둘 다 running 가능합니다. Running protocol 은 urea 가 들어가는 조건에서는 Low UHGP을 권장합니다. Urea 가 들어가지 않는 조건에서는 High HGP 를 사용하는 것이 좋고, glycerol 이 후처리에 있어서 문제가 되는 경우 protocol MP를 사용하게되나, High HGP 에 비해 separation 효율은 좀 떨어집니다. • Fraction 은 최소 14개에서 최대 70개까지 얻을 수 있으며 14, 28, 42, 56, 70 개 중에서 선택할 수 있으나, 56 또는 70개를 권장합니다. • Focusing range 는 이론상 pH 2.5~11 까지 가능하고, acidic 또는 basic region 만 선별하여 running 할 수 있으나, pH 3~10 range 조건을 권장합니다. • Fraction 은 well 당 0.6~0.7 ml 정도 얻어지고 그 농도는 running한 protein이 모든 well로 골고루 퍼졌다고 계산할 때 0.04~0.08 mg/ml 입니다. Protein 회수율은 ~90% 정도입니다. • Fraction은 deep well plate(1ml) 에 담아서 드리고 그 중 몇 개 fraction 을 4-12% Bis-Tris 12 well small gels 한 장에 걸어서 첨부하여 드립니다. • Sample preparation 과정은 제시된 비용에 포함되어 있지 않습니다. • Sample preparation 과정에서의 buffer 조성 (urea, salt 농도, detergent)은 의뢰 전에 반드시 문의하시기 바랍니다.

3. Date: Title

4. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 NuPAGE (invitrogen 4-12% Bis-Tris gel)