Utilizzo della fotoproteina equorina, derivante dalla medusa Aequorea Victoria ,

1. PMA CTR Cyt M Cyt M WB: ab anti PKCß PKCß iperespressa PKCß endogena La fotoproteina EQUORINA Scopo del progetto Misura diretta del segnale calcio Utilizzo della fotoproteina equorina, derivante dalla medusa Aequorea Victoria, per la generazione di BIOSENSORI CELLULARI in grado di rilevare importanti PARAMETRI CELLULARI bersagli dei farmaci Vantaggi: Il rapporto segnale/rumore è molto alto Il sistema di rilevamento è semplice e adatto per l’automazione Le sonde sono indirizzabili in specifiche regioni subcellulari Applicazioni: Sviluppo di tecnologie innovative per lo studio dei rapporti struttura-funzione dei recettori accoppiati a G proteine e sviluppo di sistemi “medium-high throughput” per l’individuazione di nuovi farmaci 1- Saggi di traslocazione di proteine dal citosol in membrana Nella regione subplasmalemmale della membrana cellulare la [Ca2+] è almeno 10 volte maggiore rispetto al resto del citoplasma. Quindi la traslocazione di una proteina alla membrana dal citosol può essere rilevata fondendo la fotoproteina calcio-sensibile equorina alla proteina di interesse. PMA CTR CTR PMA Immunofluorescenza sonda pKC ß-AEQ Il saggio è stato messo a punto con le pKC (protein chinasi C), importanti target farmaceutici che traslocano alla membrana dopo stimolazione, coinvolti nel diabete. Come mostrato nelle figure sopra riportate, la traslocazione in membrana della proteina dopo trattamento con PMA è stata verificata mediante Western blot e immunofluorescenza. 2-Test di tossicità cellulare 1-alterazioni della risposta calcio mitocondriale Razionale: l’alterazione del segnale calcio mitocondriale è un segnale precoce di tossicità e di morte cellulare. Questo segnale viene monitorato mediante la sonda mt-AEQ, ovvero una equorina indirizzata al mitocondrio 2-sviluppo di un saggio sensibile per la secrezione di ATP Razionale: l’ATP e’ un messaggero extracellulare coinvolto in numerose risposte cellulari come chemiotassi, rilascio di citochine e neuotrasmettitori, apoptosi e proliferazione cellulare. La sonda pmeLUC, una luciferasi legata alla membrana cellulare, è un valido strumento per sondare l’ambiente pericellulare e misurare la concentrazione extracellulare di ATP. Sonda mt-AEQ Sonda pmeLUC 3-Curve dose-risposta di farmaci agonisti e antagonisti di recettori GPCR accoppiati a Gq agonista antagonista Mediante la sonda mt-AEQ è possibile monitorare l’attivazione o inibizione di recettori GPCR che comportano variazioni nella [Ca2+]mitocondriale e correlare l’emissione di luminescenza della sonda alla dose del farmaco. Nel grafico viene illustrata la risposta dose- dipendente in seguito ad attivazione del recettore P2Y per l’ATP. Dose-risposta del consumo di equorina (destra) e segnale della chemiluminescenza dei singoli pozzetti in una piastra da 24 (sinistra) Dose-risposta dell’inibizione del consumo di equorina in presenza di un antagonista recettoriale (destra) e segnale della chemiluminescenza dei singoli pozzetti in una piastra da 24 (sinistra)