İmmunohistokimyasal Tanı Yöntemleri

1. Göğüs Hastalıklarında in vivo ve in vitro Araştırma Yöntemleri İmmunohistokimyasal Tanı Yöntemleri Prof. Dr. Hasan YÜKSEL hyukselefe@hotmail.com www.cocukalerjiklinigi.com www.cocukgogusklinigi.com Celal Bayar Üniversitesi Tıp Fakültesi Pediatrik Alerji Bilim Dalı ve Çocuk Göğüs Bilim Dalı

2. Herhangi bir çıkar çatışmam yoktur .

3. Göğüs Hastalıklarında in vivo ve in vitro Araştırma Yöntemleri İmmunohistokimyasal (İHK) Tanı Yöntemleri Deneysel modeller Malignite vb in vivo tanı Fonksiyonel proteinler (SPs, CD…) Patolojik (PAP, kollojen,…..) …….

4. Solunum Yolunda Deneysel Modeller • Astım, alerjik rinit, pnömoni, fibrozis, Tb, toksik...

5. InVivo Tanı • Solunum yolu epiteli, submukoza, parankim...

6. Işık ve Elektron Mikroskopik İnceleme farklılaşması • Astımda alveollerin ve hücrelerin IM ve EM inceleme

7. İmmünohistokimya nedir ? • Floresan, peroksidaz yöntemle görüntüleme

8. İmmünohistokimyada Boyama Yöntemleri • PAP • APAAP • (Strept) Avidin-Biotin • Polimer Bazlı Teknoloji • Eşzamanlı Birden Çok Doku Belirtecinin Boyanması (Double-Stain) DoubleStain: SARS-CoV ve sitokeratin.

9. İmmünohistokimyasal Boyamanın Kantitasyonu • Hücrelerdeki reaktivitemembranöz, sitoplazmik ve/veya nükleer olabilir. • Boyanmanın genişliğine, yoğunluğuna ve/veya kombinasyonuna göre reaktivite var bir aralıkta değerlendirilir (zayıf, orta, güçlü ; +, ++, +++ gibi…) • Kompüterize alan hesabı yapılabilir (Stereoloji…. vs)

10. Deneysel Modellerde İHK En sık kullanım. Hava yolu İHK Parankim İHK BAL İHK ……

11. InVivo Tanıda Panel Seçimi Panel seçiminde algoritm önemlidir

12. İmmünohistokimyasal Yöntemlere Destek Yöntemler İmmunohistokimyasının western-blot ile kantitatif hale getirilmesi Kök hücrenin FISH ile gösterilmesi

13. İHK Yöntemler: Farklılaşan Hücrelerin Tanımlanmasında • Markırlar ile hücreler ve differansiasyon evreleri İHK olarak tanımlanır

14. Patolojik Durumlarda İHK Yöntemler Örnekleme • Deney hayvanlarından alınan dokular • Hücre kültürü • Aspirasyon materyalleri, • Bronkoalveoler lavaj gibi sıvılar • Biyopsi

15. Patolojik Durumlarda İHK Yöntemler

16. İHK ile incelenebilir ve ölçülebilir kavramlar 1. Yapisaldegisimler: Stereoloji, bronscapı/mukoza oranı, alveol….)2. İnflamasyon: Hücreler, stereoloji vb, inflamasyon tipi…3. Remodelling: Rbm kalınlığı, bronş kas hipert, goblethiperpla, fibroz 4. Mediator/sitokinler: TGF, IL-4, IL-10, Treg5. Reseptorler ve proteinler: VEGF-r, ZO-1, ..6. Apopitozis, Efferositozis7. EM-Ultrastruktur-ince yapı 

17. İHK ile incelenebilir ve ölçülebilir kavramlar 1. Yapisaldegisimler: Stereoloji, bronscapı/mukoza oranı, alveol….)2. İnflamasyon: Hücreler, stereoloji vb, inflamasyon tipi…3. Remodelling: Rbm kalınlığı, bronş kas hipert, goblethiperpla, fibroz 4. Mediator/sitokinler: TGF, IL-4, IL-10, Treg5. Reseptorler ve proteinler: VEGF-r, ZO-1, ..6. Apopitozis, Efferositozis7. EM-Ultrastruktur-ince yapı 

18. İHK ile yapısal değişiklikler: Deneysel Modeller • Astım/rinitte hücrelerin tipinin ve lokalizasyonunun saptanması. • Yapısal ve patolojik proteinlerin tipinin ve lokalizasyonunun saptanması.

19. İHK ile yapısal değişiklikler • Etiopatogeneze katkı • İnflamasyonda hücre çeşitliliğinin ve birikme yerlerinin saptanması • Tedavinin şekillendirilmesi

20. İHK ile yapısal değişiklikler • Akciğerdeki diffüzparenkimal akciğer hastalıklarında, • Astımve KOAH …. • İnflamatuvar hücre çeşitleri ve sayılarının saptanmasında, • Akciğerin benign ve malignneoplazmlarında, • Patogenez ve tedaviye yönelik deneysel çalışmalarda kullanılmakta .

22. İHK ile incelenebilir ve ölçülebilir kavramlar 1. Yapisaldegisimler: Stereoloji, bronscapı/mukoza oranı, alveol….)2. İnflamasyon: Hücreler, stereoloji vb, inflamasyon tipi…3. Remodelling: Rbm kalınlığı, bronş kas hipert, goblethiperpla, fibroz 4. Mediator/sitokinler: TGF, IL-4, IL-10, Treg5. Reseptorler ve proteinler: VEGF-r, ZO-1, ..6. Apopitozis, Efferositozis7. EM-Ultrastruktur-ince yapı 

23. Mukoza Biyopsisi • Altın standard

24. İHK ile İnflamasyon Nazal polipdeT-regulatör hücre düşüklüğü • Ekspresyon oranları; • FOXP3, T-bet, GATA-3, • TGF-β1, IL-10 and • TH1/ TH2 sitokin oranı (IFN-γ , IL-4, IL-5, IL13) N. Van Bruaene et al,JACI 2008.

25. Nazal polipde inhibitör T-hücre yanıtı * * * * * Van Bruaene et al, submitted

26. Astımda BAL da ECP ve IL-8 Kim Clin Exp Allergy 2005;35:591-7

29. İHK ile incelenebilir ve ölçülebilir kavramlar 1. Yapisaldegisimler: Stereoloji, bronscapı/mukoza oranı, alveol….)2. İnflamasyon: Hücreler, stereoloji vb, inflamasyon tipi…3. Remodelling: Rbm kalınlığı, bronş kas hipert, goblethiperpla, fibroz 4. Mediator/sitokinler: TGF, IL-4, IL-10, Treg5. Reseptorler ve proteinler: VEGF-r, ZO-1, ..6. Apopitozis, Efferositozis7. EM-Ultrastruktur-ince yapı 

30. Astımda İnflamasyon Akut İnflamasyon eklenmesi Kronik inflamasyon Havayolu remodelingi Yapısal değişiklikler Zaman www.alerjiklinigi.com

31. İHK ile Remodelingin Değerlendirilmesi RBM kalınlaşması (neoanjiogenzis + fibrinoid) kas hücresi ve goblethiperplazikantitasyonu

32. Hoshino M. Gene expression of vascular endothelial growth factor and its receptors and angiogenesis in bronchial asthma. J Allergy Clin Immunol 2001;107:1034-8. Neden nazal mukozada AZ/YOK ?

33. İHK ile Remodelingin Değerlendirilmesi VEGF ve remodelling (neoanjiogenzis + fibrinoid) • VEGF, endotel hücreler için çok spesifik mitojenik etkileri nedeniyle anjiogenezisis ve lenfanjiyogenezisi tetikleyici etkileri olan bir moleküldür. • VEGF ailesi yedi tane üye içerir: • VEGF-A, • VEGF-B, • VEGF-C, • VEGF-D, • VEGF-E, • VEGF-F, • PlGF. • Tüm üyeler VEGF homology parçası bulundururlar. Akciğerde bulunur

34. VEGF Remodeling flk-1 Sistemik Allerjik Enflamasyonun Eş Zamanlı İki Doku Tutulumu flk-1 (VEGF-R) VEGF p > 0.05 p < 0.05 p < 0.05 p < 0.05 Yuksel H et al, Increased exp. of tissue VEGF and flk-1R in seasonal allergic rhinitis and relevance to asthma component. Clin Exp Allergy 2007.

35. İHK ile Remodelingin Değerlendirilmesi VEGF ve remodelling (neoanjiogenzis + fibrinoid) neden ÖNEMLİ ? H&E ile boyanmış akciğer kesitleri Bronşiyolerde VEGF-pozitif hücreler BAL sıvısında VEGF-pozitif hücreler Plasebo TDI TDI + VEGFR inhibitörü www.alerjiklinigi.com Lee YC, et al. J Immunol 2002;168:3595-600.

36. Nitrik Oksit Metabolizmasının Rolü p>0.05 AR p<0.05 Kontrol Yüksel H et al. Nasal mucosal expression of nitric oxide synthases in patients with allergic rhinitis and its relation to asthma. Ann Aller Asthma Immunol. 2008

37. Nitrik Oksit Metabolizmasının Rolü iNOS Birleşik Hava Yolu Hastalığı Patogenezi p<0.05 p<0.05 İnhale NO iNOSEkspirasyonu Enflamatuvar Potansiyel Yüksel H et al. Nasal mucosal expression of nitric oxide synthases in patients with allergic rhinitis and its relation to asthma. Ann Aller Asthma Immunol. 2008

38. İHK ile incelenebilir ve ölçülebilir kavramlar 1. Yapisaldegisimler: Stereoloji, bronscapı/mukoza oranı, alveol….)2. İnflamasyon: Hücreler, stereoloji vb, inflamasyon tipi…3. Remodelling: Rbm kalınlığı, bronş kas hipert, goblet hiperpla, fibroz 4. Mediator/sitokinler:TGF, IL-4, IL-10, Treg5. Reseptorler ve proteinler: VEGF-r, ZO-1, ..6. Apopitozis, Efferositozis7. EM-Ultrastruktur-ince yapı 

39. CoordinateGeneExpression T -Cells (CD4+) ––– Eosinophils ––– Macrophages ––– Epithelial Cells ––– Smooth Muscle Cells Pathology AcuteInflammation ––– ProgressiveChronicInflammation ––– AirwayRemodeling GeneProducts Cytokines ––– Chemokines ––– CellAdhesionMolecules ––– Enzymes GeneticFactors EnvironmentalFactors (Smoke, allergens) Corticosteroids İHK ile Meditör/Sitokinlerin Değerlendirilmesi Astım: Kronik hava yolu inflamasyonu ve mikroçevre değişiklikleri

40. Asthma COPD Normal Normal Asthma COPD İHK ile Meditör/Sitokinlerin Değerlendirilmesi Astım: DPP10 (dipeptidilpeptidaz 10) nun astım ve koahdakimukozal lokalizasyonu.

41. 7. Epiteliyal Bariyer Disfonksiyonu Epiteliyal bariyer disfonksiyonu alerjik enflamasyondan önce var olan primer neden olabilir !!! Kontrol Alerjik Rinit n=10 n=10 Yuksel H, et al. Epithelialbarrierdysfunction in pathogenesis of allergicrhinitis: ZonulaOccludens-1 protein. VI. W ImmuneReg. Meeting. March 2011. Abstr no 112.

42. İHK ile incelenebilir ve ölçülebilir kavramlar 1. Yapisaldegisimler: Stereoloji, bronscapı/mukoza oranı, alveol….)2. İnflamasyon: Hücreler, stereoloji vb, inflamasyon tipi…3. Remodelling: Rbm kalınlığı, bronş kas hipert, goblet hiperpla, fibroz 4. Mediator/sitokinler:TGF, IL-4, IL-10, Treg5. Reseptorler ve proteinler: VEGF-r, ZO-1, ..6. Apopitozis, Efferositozis7. EM-Ultrastruktur-ince yapı 

44. İHK ile Meditör/Sitokinlerin Değerlendirilmesi Astım: EGF-R, MUC5A, MUC5B değişiklikleri

45. Nitrik Oksit Metabolizmasının Rolü p>0.05 AR p<0.05 Kontrol Yüksel H et al. Nasal mucosal expression of nitric oxide synthases in patients with allergic rhinitis and its relation to asthma. Ann Aller Asthma Immunol. 2008

46. Nitrik Oksit Metabolizmasının Rolü iNOS Birleşik Hava Yolu Hastalığı Patogenezi p<0.05 p<0.05 İnhale NO iNOSEkspirasyonu Enflamatuvar Potansiyel Yüksel H et al. Nasal mucosal expression of nitric oxide synthases in patients with allergic rhinitis and its relation to asthma. Ann Aller Asthma Immunol. 2008

47. İHK ile incelenebilir ve ölçülebilir kavramlar 1. Yapisaldegisimler: Stereoloji, bronscapı/mukoza oranı, alveol….)2. İnflamasyon: Hücreler, stereoloji vb, inflamasyon tipi…3. Remodelling: Rbm kalınlığı, bronş kas hipert, goblet hiperpla, fibroz 4. Mediator/sitokinler:TGF, IL-4, IL-10, Treg5. Reseptorler ve proteinler: VEGF-r, ZO-1, ..6. Apopitozis, Efferositozis7. EM-Ultrastruktur-ince yapı 

48. İHK + EM ile Akciğerin Ultrastrüktürel Değerlendirilmesi

49. İHK + EM ile Akciğerin Ultrastrüktürel Değerlendirilmesi

50. Teoriden Nümerik Değere: Akciğerin Stereolojik İncelenmesi • Parankimal hücreler, • Organeller, • Parankimal yeniden şekillenme, • Astım/Amfizem benzeri patholojilerde: • alveol tip II hücre hiperplazisi ve hipertrofisi • hücreiçisürfaktan değişiklikleri değerlendirilebilir. • Alveollerin sayıları ve alveolar açıklıkların sayıları • Alveol yüzey alanı (Alveolarsurfacedensity : ASD) • Işık mikroskop altında • sistematik rastgele- fiziksel disektorkullanılarak hesaplanabilir.