Download
1 / 130
1.3k likes | 4.64k Views
I- GENEL BAKIS;. KLINIK IMMUNOLOJIDE HASTALIGIN TANISI I
E N D
1. IMMUNOLOJIK TANI YÖNTEMLERI
Prof. Dr. Bekir KOCAZEYBEK
2. I- GENEL BAKIS; KLINIK IMMUNOLOJIDE HASTALIGIN TANISI IÇIN
Çok iyi bir ÖYKÜ alinmasi
FIZIKI INCELEME yapilmasi
Uygun TANI TESTININ yapilmasi
ZORUNLUDUR
3. a)ÖYKÜ: KLINIK IMMUNOLOJI UZMANINA BASVURU NEDENLERI(siklik sirasiyla);
ENFEKSIYONLAR (en sik)
? Yineleyen enfeksiyon
? Çocuklarda bulasici ÜSYE çok siktir
? Bu çocuklarda sekonder olarak
? Otit, sinüzit, bronsit gelisebilir
? Bu hastaliklar diger çocuklara görülmesine göre daha siksa
? Antibiyotik almayi gerektiriyorsa
? Ig G alt sinif yetersizligi vardir
? Deri ve ÜSYE’nin;
? 6-12 aydan sonra baslamasi
? Sik ve birincil olmasi
? Ig yetersizligini gösterir
4.
? Çok agir enfeksiyonlar
? Agir viral enfeksiyonlar
? T hücre yetersizligi
? Agir bakteri enfeksiyonlar
? B hücre yetersizligini gösterir
? Firsatçi mikroorganizmalarla enfeksiyon
? Hastane enfeksiyon etkenleri
? KIT’ de CMV enfeksiyonu
? Dogal ve özgül immunitede
? Özellikle T hücre bozuklugu
5. ? Kendine özgü mikroorganizmlarla enfeksiyon
? Aspleniklerde
? Pnömokok enfeksiyonu
? Enflamasyonsuz enfeksiyon
? Aplastik anemi, nötropenik ve disfonksiyonel nötrofiliklerde
? Pyojenik bakterilere dirençsizlik
? Kronik enfeksiyon
? Kronik ishal yada büyüme bozuklugu olanlarda
? sIgA yada T hücre yetersizligi
? Rotavirus, G. lamblia enfeksiyonu
6.
IMMUN YETERSIZLIGE BAGLI;
? HASTALIK BELIRTILERI
? Allerjik
? Artrit
? Deri degisiklikleri
? Malign hastaliklarla ilgili belirtiler
7. b)FIZIKI INCELEME: Hastada enfeksiyon bulunup bulunmadigi;
? VARSA;
? Hastanin genel yaniti, saglik durumunun gözlenmesi
Hastalarda;
? Solgunluk
? Kanama odaklari
? Deride kolay morarma
? Döküntü
Hastanin;
? Lenf bezleri ve bademcikleri var olup olmadigi
? Büyüklügü saptanmalidir
? Agir T hücre yetmezliginde lenf bezi ele gelmez
? Bademcikler görünmez
8. Normal bebeklerde dalagin alt ucu ele gelir
? Ancak dalak yoklugu (aspleni ile)
? Bakteriyel (kapsüllü) enfeksiyonlar siktir
Agizda pamukçuklarin olmasi
? T hücre yetersizligi
? Candida sp
Bazi özel sendromlara spesifik;
? Hastalik ve/veya bulgularin olmasi
? Di George sendromunda
? Neonatal tetanoz ve KKH
? Wiskott-Aldrich sendromu
? Egzama
? Kolay kanama egilimi
? Petesi
9. c)TANI TESTLERI: UYGUN TANI TESTI NE DEMEK?
? Hastanin klinigine paralel dogru seçilmis
? Laboratuvar da özenle yapilmis
? Sonucu titizlikle açiklanmis testtir
10. UYGUN TANI TESTI ISTEMENIN NEDENLERI
? Immun sistem çevre ile dinamik bir dengede oldugu için;
? Çogu testin spektrumu genistir
? Immunolojik testlerin BAZILARI;
? BIOASSAY (yasam sürecinde inceleme) oldugundan
? Test sirasinda kontrol edilemeyen degisken faktörlerden etkilenirler
? Bundan dolayi testler
? Ayni yas ve zamanda
? Hasta ve kontrol gruplarinda yapilmalidir
11.
? Bazi testler ilgili laboratuvarda az yapilir
? Bundan dolayi
? Bu birim sürekli nitelik kontrolü yapmasi gerekir
? Test sonuçlari
? Klinik durumla paralel açiklanmasi gerekir
ÇÜNKÜ;
? Baska ikincil hastaliklar
? Veya metabolik bozukluklar sonuçlari etkiler
? Immunolojik testler
? Özel araç- gereç ve uzman ekipmanli laboratuvarlar gerektirdiginden pahalidir
12.
13. IMMUNOLOJIK TESTLERDE KLINIK ÖRNEKLER Venöz damardan kan alinabilir
Humoral immuniteyle ilgili
? Serum (antikoagulansiz kan)
Hücresel immuniteyle ilgili
? Heparinlenmis taze kan ve eriyik maddeler
? Invivo uygulamalar (cilt testleri)
Immuno genetik çalismalarla ilgili
? Kan örnekleri
? Taze veya fikse edilmis dokular
MHC tayini ile ilgili
? Serum
? Heparinize kan
14. II- HUMORAL IMMUNITE ÖLÇÜM YÖNTEMLERI Mikroorganizmalarin yapitaslarina karsi hümoral ve hücresel immünite gelisir.
? SEROLOJI;
? Serum bilimi
? Immunoloji bilim dalinin bir alt disiplini
? Serum disinda;
? BOS, diski, gözyasi, sinovyal sivi v.b.
? Seroloji bilimi antijen-antikor reaksiyonlarini laboratuvar ortaminda saptar.
? Enfeksiyon hastaliginin tanisina in direkt yardimci olur.
15. Serolojik tani neleri amaçlar?
1- ETKENINI TANIMLAMAK;
Dikkat edilecek üç kriter vardir
a) Tek bir serum örneginde;
? Yüksek titrede spesifik IgM yaniti ? Veya IgM negatif IgG pozitif ise;
? 3 hafta sonra serumda
? 4 kat titre artisi
b) Akut hastalik dönemi ile nekahet dönemi antikorlarinda;
? 4 kat titre artisi
?Total antikor yanitinda
c) Nadir görülen enfeksiyonlarda;
? Tek serum örneginde
? Özgül IgM antikor yaniti
? Kuduz, botulizm
16. Serolojik tani neleri amaçlar?(II) 2. Enfeksiyon hastaligini dogrulama,
3. Bir kisinin ya da toplumun bagisikligini saptama ? Anti-HAV IgG,
? Anti-HBs
4. Etkenlerin serogrup, serotip veya immuno tiplendirilmesi
? E. coli’de ETEC, EPEC gibi
5. Hastaligin prognozu
? HAV IgM yaniti,
? HBV’de hepatit belirteçleri
17. Serolojik Tanida Klinik Örnek Uygunlugu Serum, plazma, plevra-periton-eklem sivisi, BOS ve doku kesitleri
Serumu eldesi aseptik kosullarda olmali ve
? Hemolizli, lipemik, fibrinli olmamali
Serolojik testler test kuralina göre çalisilmali
Örnegin: Soguk aglütinasyon
Taze serumla çalisilmali,
? Çalisilamiyorsa;
? Testlerin özelligine göre 40C, -22, -40, -700C’ de saklanmali
Serumlarda dondurma ve çözme islemi bir kez yapilmali
Bazi hastaliklarda kan alim araligi önemli
Örnegin: M.pneumoniae’de 5-7 gün gibi
18. Serolojik Tanida Invitro Test Prensipleri IgG’nin moleküler yapisi
19. Antijen (Ag)- Antikor (Ab) birlesmesinin özellikleri Antijen-antikor birlesmesi kimyasal bir reaksiyondur
Özgül bir reaksiyondur
Geriye dönüsür bir reaksiyondur
Antijen ve antikor uygun oranlarda bir araya getirildiginde maksimum reaksiyon olusur
Iki safhali reaksiyondur:
1. safha çok kisadir, gözle görülmez
2. safha uzundur, gözle görülür.
20. Antijen-antikor birlesmesinde rol oynayan kuvvetler 1- Elektrostatik kuvvetler
2- Hidrojen baglari
3- Hidrofobik moleküllerin olusturdugu kuvvetler
4- Van der Walls kuvvetleri
21. SEROLOJIK TEST YÖNTEMLERI 1)PRESIPITASYON;
Çözünür haldeki antijen ve özgül antikorlarin
? Optimum konsantrasyonda karistirilmasi ve
? Birlesmesine bagli gelisen reaksiyona denir
? Reaksiyon sonucu
? Kompleks (presipitat)gözle görülür
? Birkaç dakikadan,1-2 güne kadar uzayabilir
Reaksiyonda
? Optimum Ag ve Ab miktari önemlidir
? AYRICA;
? PH, elektrolit ve isi da önemlidir
22. Presipitasyon reaksiyonlari;
Pasif difüzyon seklinde
? Sivi ortamda difüzyon
? Halka ve kapiller tüp
? N. menengitidis, S. pneumoniae, H.influenzae Ag
? Jel (agar)ortamda difüzyon
? Tek yönlü (Quidin tüp) veya çift yönlü dif.
? Çesitli virus ve bakteri Ag belirlenmesinde kullanilir
? Tek yönlü (Radyal) (Mencini plak)
? CRP, serum Ig ve kompleman düzeyleri
? Türbidimetrik ve nefolometrik cihazlar gelistirilmistir
? Çok sayida kan degerlendirilmesi için
? Çift yönlü (quchterlonoy plak)
? Aspergilloz, histoplasmoz, blastomikoz Ag’lerin belirlenmesinde
23. ¦ ELEKTRO- IMMUN DIFÜZYON Elektrikli ortamda; ? Antijenler elektriksel alanda ayrilirlar (elektroforez)
? Elektroforez için degisik matriksler;
? Kagit
? Sellüloz asetat
? Agar
? Poliakrilamid kullanilir
? Immun difüzyon ve elektroforezin birlestirilmis teknigine
IMMUNELEKTROFOREZ denir
? Serum proteinlerinin tanimlanmasinda
? Ig siniflari ve agir, hafif zincirlerdeki anormalliklerin saptanmasinda
? Basit, tek yönlü (laurell)(roket elektroforezi)
? Titresi bilinmeyen bir antijenin titresini belirler
? Karsit( zit yönlü) IEF
? HBV Ag ve Ab saptanmasinda
? Septik menenjit, pnömoni, septik artrit vb etken Antijen saptanmasinda
24. 2) AGLUTINASYON: Dogal olarak antijen tasiyan
? Bakteriler, Eritrositler, Lökositler
Yüzeylerinde yapay olarak antijen bulunan
? Eritrosit, Latex, Bentonit
? Polistren gibi sentetik parçaciklarin
? Elektrolitli bir ortamda
? Tasidiklari antijenlerle,
? Spesifik antikorlarin
? Kümelesme yaparak çökmesine denir
Lamda, tüpte mikroplaklarda yapilirlar
Ikiye ayrilir
? Aktif aglutinasyon
? Pasif aglutinasyon
25. AKTIF AGLUTINASYON;
DIREKT
? Aglutinasyonda rol alan antijen partikülün kendisidir
? Bakterilerin antijenleri
? Gruber- Widal, Wright, WF
? Kan grubu antijenleri
? Aktif hemaglutinasyon
? ABO, Rh, Vd
? Forward
? Reverse
? Cross-Matching
? Major
? Minor
? Soguk aglutinasyon
? M.pneumoniae
? Paul- Bunnel
? EBV
26. AKTIF AGLUTINASYON; INDIREKT
? Antijen ve antikorun baglanmasinda ikincil bir antikorun kullanilmasi
? Antiglobulin Ab (tavsan kaynakli - ticari)
? Direk Coombs
? Eritroblostasis fetalisli çocuklarin eritrosit yüzeyindeki Ab saptanir
? Indirekt Coombs
? Rh (-) annenin serumdaki Anti-Rh Ab’ler saptanir
31. PASIF AGLUTINASYON ANTIKOR (Ab) ARANIYORSA
? Aglutinasyonda rol alan antijenler
? Polisakkarit veya
? Proteinler (tannik asitle)
? Eritrosite baglanirsa
? HEMAGLUTINASYON
? VZV, Rubella, CMV, T.gondii
? Latex partikülleri, bentonit, kömür vb
34. PASIF AGLUTINASYON ANTIJEN (Ag) (TERS PASIF) ARANIYORSA;
? Eritrosit, latex, bentonit, kömür
? S.aureus covan 1
? Antikorun Fc’sine baglanir
? Latex Agg (LA)
? Ko Agg (CoA)
? Serum, BOS, idrarda
? Bakteriyal polisakkarit Ag’leri
? N.menengitidis
? Hib
? S.pneumoniae
? C.neoformans
? Streptokok gruplandirilmasi,
? S.aureus koagulaz deneyi
? Çesitli bakteri ve virusta ag tayinleri
35.
Hemaglutinasyon- inhibisyon (HI) testi
? Hemaglutinasyonu engelleyici antikorlarin saptandigi testtir
? Hastanin serumu seri dilusyon edilir
? Üzerine standardize sabit virus antijeni konulur
? Eritrositler eklenir
? Serumda Ab’ler varsa
? Hemaglutinasyonun görülmedigi son titre pozitif sonuçtur
? Influenzae, Kabakulak, Rubella enfeksiyonlarinda
36. 3)KOMPLEMAN BAGLAMA TESTI
Antijen ve antikor birlesmesinin komplemani uyarmasina dayanarak gelistirilen iki basamakli testtir
Antikor (siklikla) ve antijen saptayabilen yari kantitatif bir yöntemdir
Test birbirinden farkli üç komponent içerir
? Test sistemi
? Hasta serumu (inaktif/aranan Ab)
? Antijen (bilinen)
? KOMPLEMAN(kobay veya tavsan serum)
? Indikatör sistemi (hemolitik sistem)
? Koyun eritrositleri
? Koyun eritrositlerine karsi Ab
37. DEGERLENDIRME; Hasta serumunda Ab varsa
? Ag ve Ab birlesecek (klasik yol)
? C, Ag ve Ab’ye baglanacak
? Ortamda C kalmayacagi için
? Hemolitik sisteme baglanamayacak
? Hemoliz olmayacak
? Bazi viral, riketsiyal ve fungal hastaliklarin tanisinda
? 1990’li yillarda Sifiliz için KOLMER
Kompleman komponentlerindeki düzey ölçümüyle;
AMAÇLANAN;
? SLE benzeri klinik tablolarin tanisinda
? C2 yetersizligi yardimci olur
? Yineleyen bakteri enfeksiyonlarinin tanisinda
? C3 yetersizligi yardimci olur
? Radyal immun difüzyon
? RIA
38. 4)FLOKÜLASYON Kardiolipin antijenin sifilitik hasta serumlarindaki reaginlerle birleserek olusturduklari,
VE; Toksin ile anti toksinin uygun miktarda karsilastiklarinda meydana getirdikleri
? KÜMECIKLERE denir
Bu kümecikler gözle yada küçük büyütmelerle görülebilir.
? Toksoid asilarin miktar tayininde kullanilir
? AYRICA;
? Sifilizin tarama testlerinde;
? Rapid plazma reagin (RPR) direkt, VDRL kadar ise serum inaktif edilerek çalisilir.
? Bunlar tüplerde veya özel lambalarla kalitatif (RPR) ve kantitatif (VDRL) olarak yapilabilirler.
? RPR, 4+’dan (-) kadar, VDRL de ise ½ den baslayan ve yukari titrelere kadar varan titrede sonuç verilir.
39. 5)NÖTROLIZASYON
Bir mikroorganizmanin
? Enfektivitesini veya
? Bir ürünün toksik etkisini
? Özgül antikoru ile etkilestikten sonra
? Kaybetmesine denir
40. Nötrolizasyon Invitro ve invivo yapilabilir
? En sik uygulanan toksin nötrolizasyon deneyidir
? Özgül Ab ve toksin karistirilir
? Hücre kültürüne
? Hayvana verilir
? Hücre kültürü canli kalir
? Hayvan yasar
? ASO deneyi
? AGBHS’ de Streptolysin O’ya karsi
? Anti- Streptolysin O olusur
? Nötrolizasyon sonucu
? Indikatör olarak eritrositlerde erime olmaz
? Birçok viral enfeksiyon tanisinda
? Nötrolizan Ab’lerin saptanmasi
? Çift serumda Ab titresinin artisiyla saglanir
41. G)IMMUNOASSAY TESTLER Isaretli antikorlarin kullanilmasiyla
? 1942’de;
? FA Fluoresan Antikor (Fluorokromlar)
? 1954’de;
? IFA (Indirekt Fluoresan Antikor)
? 1960’da;
? RIA (Radyoizotopla- iyotla)
? 1970’de;
? EIA (enzimle) kullanima girmistir
? Antikor yada antijen saptamak için kullanilirlar
42. I- Immun Fluoresan (IF) testler
FLUORESANS
? Fluorokrom veya florofor boyalarin
? Ultraviyole isik altinda
? Isik enerjisini emerek
? Bu enerjiyi farkli dalga boyuna çevirmesine denir
43. Antikorlar en sik fluoresin isotiyosiyanat (FITC) ile isaretlenir. BUNA GÖRE;
? Direk fluoresan antikor (DFA)
? Kati fazda klinik örnek (Ag)
? Üzerine FITC’li Ab
? Pozitif sonuç (fluoresan-yesil görüntü)
? Bakteri ve viruslerin hizli tanida
? Kuduzda negri cisimcigi
? Kolera tanisinda
? Indirek fluoresan antikor (IFA)
? Kati fazda hazir Ag
? Hasta serumu(aranan Ab)
? FITC’li Anti-Ig
? Pozitif sonuç (fluoresan görüntü)
? Birçok bakteri virus enf ve otoimmun hast.
? FTA- Abs (T.pallidum)
? ANA, AMA vb
IF yöntemiyle klinik örneklerden hem Ag hem Ab aranir
Fluoresan mikroskobu olmasi ve uzman kisi gereklidir
44. II-Radioimmuno Assay (RIA) Yöntem ayni IF ve EIA gibidir
Antikorda isaretliyici madde olarak
? Radyoaktif madde
? I. 125 ve I. 132 kullanilir
? Gamma sayaçlarinda degerlendirilir
? Radyoaktif madde kullanimindan dolayi sinirlidir
? Özellikle hormon testlerinde (TSH, T3, T4) kullanilir
? Radyo allergo sorbent (RAST) deneyi
? Allerjene spesifik IgE tayininde kullanilir
? Radioimmunosorbent (RIST)
? Serumda total IgE tayininde
45. III. ELISA (Enzyme Linked Immunosorbend Assay) ENZIMLE ISARETLENIR.
? Antijen veya antikorun;
? Çesitli vücut sivilarinda varligini
? Çok duyarli bir biçimde (<1 ?g) gösterilmesine dayanir.
? Makro ve mikrosistem sekilleri vardir.
? HIV, hepatit, TORCH ve sitokin çalismalarinda;
? Çok sik kullanilir
? Son yillarda gelistirilen
? MEMBRAN ELISA adi verilen;
? Ag ve Ab’nin kromotografik (renkli bir çizgi veya noktacik) olarak,
? Bir membran zemindeki reaksiyonuna dayanan
? Rapid (hizli) yöntemleri gelistirilmistir.
? Acil durumlarda kullanilirlar
? ANCAK duyarliliklari hazirlanma teknigine bagli olarak düsük olup,
? YALANCI NEGATIFLERE dikkat etmek gerekir.
46. EIA OTOMATIK SISTEMLERI Kan bankasi rutin çalismalarina son yillarda giren sistemlerdir.
Makro sistem, kapali sistem olarak da bilinen sistemlerdir.
Çalisma sistemleri ve Prensipleri;
? Kapali bir cihaz
? Ve bu cihazda çalismaya uygun kitler ile
? Cihaza bagli bilgisayar ve yazici.
Piyasada en sik bulunan
? EIA otomatik sistemler;
? Enzyme-linked flureskent assay (ELFA)
? Mikro partikül enzim immuno assay (MPEIA)
? Fluoresan polorizasyon immuno assay (FPIA)
? Chemiluminescent Assay (CA)
yöntemleri ile çalismaktadir.
47. ELIZA yöntemi dört sekilde uygulanir: A) Serumda Ab araniyorsa:
(sandwich)
Kati yüzeyde Ag + süpheli serum (Ab)
Yikama
Üzerine;
? Enzimle isaretli anti-Ab konjugati
Substrat ilave edilir
Renk olusur.
48. B) Serumda Ag araniyorsa: (sandwich)
Kati yüzeyde Ab+süpheli serum (Ag)
Yikama,
Üzerine;
? Enzimle isaretli Anti-Ab konjugati
Substrat ilave edilir
Renk olusur
49. C) SERUMDA AG ARANIYORSA (Competetive-Yarisma)
Kati yüzeyde Ab
? Süpheli serum (Ag aranan klinik örnek)
? Ve enzimle isaretli antijenin beraber konuldugu,
? Antijen rekabet (Competetive) yöntemidir.
Isaretli antijen kati yüzeye baglanirsa,
? Substratla da birlesir
? RENK OLUSUR.
? Bu sonuç klinik örnekteki Ag’nin olmadigi bir sonuçtur.
Fakat klinik örnekteki antijen kati faza baglanirsa
? Enzim olmadigindan substratla reaksiyon olmaz.
? RENK OLUSMAZ.
? Bu sonuç klinik örnekteki Ag’nin oldugunu gösterir
50. D) spesifik antijen ve antikor yakalama
(immun capture)
Siklikla;
? Enfeksiyoz etkene yönelik,
? Spesifik IgM ve IgG saptama testidir
1)Spesifik Ag saptama ? Kati faza poliklonal veya M.ab’lar konulur
? Poli Ab’ler,
? M Ab’lere göre
? Farkli Ag epitoplarini bagladigi için güvenilirdir
51. 2)Spesifik Ab (IgM) saptama
Kati faz formu
? IgM’in Fc bölgesine karsit anti-IgM Ab kati faza baglanir
? Üzerine hasta serumu (IgM?) konulur
? Üzerine viral antijen
? Enzimle isaretli antikor
? Substrat…
Konjugat faz formu
? Kati fazda viral Ag
? Hasta serumu (IgM?)
? ENZIMLE ISARETLI anti IgM Ab (KONJUGAT)
? Substrat…
52. IV-WESTERN- BLOT Viral lizat veya rekombinant antijenler Sodyum dodesilsulfat yardimiyla (SDS)
POLIACRYLAMID JEL zemininde, molekül agirliklarina göre elektroforetik olarak ayrilir.
Polipeptit antijenler, ikinci bir elektroforez ile NITROSELÜLOZ MEMRAN SERITLER ÜZERINE transfer edilir.
Hasta serumu ile serit üzerindeki antijenler özel bir testte temas ettirilir (elektroforetik yöntem)
Hasta serumunda aranilan antikorlar varsa, serit üzerindeki antijen bulunan BANDLARDA RENK KOYULUGU (KOYU-ZAYIF-RENKSIZ) olusur.
Kitin internal Pozitif ve Negatif kontrollerindeki band renkleri degerlendirmede önemlidir.
Ve band için, HANGI ANTIJEN VARSA REAKTIF kabul edilir.
Seritlerin üzerindeki bandlarin pozitifligine göre o hasta için, etkenin sonuç virulansi patternlerine göre POZITIF-NEGATIF VEYA SAPTANMAYAN sonuç verilir.
? Etkene özgü IgM, IgG, IgA antikorlarina göre test yapilabilir.
? HIV, H.pylori ve T.pallidum enfeksiyonlarinin tanisinda özgüllügü yüksek olarak kullanilmaktadir.
55. III-HÜCRESEL IMMUNITE ÖLÇÜM YÖNTEMLERI
HÜCRESEL IMMUNITEYE YÖNELIK TEST YÖNTEMLERI
? IKI BASLIK ALTINDA INCELENIR
INVITRO TEST YÖNTEMLERI
INVIVO TEST YÖNTEMLERI
56. A)INVITRO TEST YÖNTEMLERI 1)LÖKOSIT SAYIM VE FENOTIPLEMESI
LÖKOSIT SAYIMI
? Mikroskopik yöntemlerle
? Hemositometrik hücre sayimi
? Isik mikroskobu (40’lik)
? Thoma ve Neabaur lamlari
? %0.4’lük tripan mavisi
? Rutinde Pek kullanilmiyor
? Gelismis immuno hemotolojik cihazlar
? En uygun yöntemdir
? Piyasada farkli firma cihazlari var
57.
LÖKOSIT FENOTIPLEMESI
? Vücudun degisik bölgelerinde
? Kemik iligi, kan, dalak ve lenf nodüllerinde
? Lökositlerin sayi ve tipleri
? Lenfositlerin
? B lenfositleri
? T lenfositleri
? T4 ve T8
? Monositlerin
? Granülositlerin
? Nötrofiller
? Bazofiller
? Eozinofiller
? Immuno hematolojik cihazlar,
? Flowsitometrik cihazlarla
58. ? Hücre yüzey moleküllerinin (Marker) fenotiplemesi
? CD (cluster of differntiation – farklilasma kümeleri) antijenleri
? Hematopoetik hücrelerin yüzeyinde yer alirlar
? 250’ye yakin CD tanimlanmistir
? Örnegin CD4 T, CD8 T, CD45 B lenfosit gibi
? Lökositlerin yüzeyindeki CD antijenik epitoplari
? Monoklonal antikorlarin (MAbs)
? Fluoresan boyalar
? Enzimlerle konjuge edilerek
? Fluoresan mikroskobuyla
? Flow sitometri cihazlariyla( EN SIK)
* Kantitatif analizi ve
* Hücre ayrimi ve tanimlamasi yapilir
59. FLOWSITOMETRI ÇALISMA PRENSIBI;
Fluoresanlanmis (FITC ile) M Ab ile isaretlenmis hücreler
Sivi bir ortamda sira halinde uyarici isiktan (Argon lazer) 488nm’de geçirilirler
? Uyarici isigi
? Hücreler kirarlar veya
? Florokromla isaretlenmis m Ab’lerin baglandigi hücre tarafindan emilir ve yayilir
? Bu yayilan isigin siddetini ve niteligini algilayan dedektörler bilgisayara aktarirlar
? Buna göre;
? Hücrenin tipi ve sayisi belirlenir
60. 1’den 10’a kadar renk eklenebilir – ve bu sayi artmaktadir
61. KLINIK KULLANIMI
? Lökosit fenotiplemesi (EN SIK)
? Konjenital veya kazanilmis immun yetersizlik tanisi (en sik AIDS)
? HIV pozitifliginde prognoz degerlendirilmesi
? Immun yetersiz hastalarda immuniteyi yada kemoterapi monitörizasyonu
? KIT yapilan hastalarda yeni immun durumun takibi
? Tümör hücre fenotiplemesi
? Lösemi ve lenfoma tani ve siniflamasi
? B lenfositlerinde klonal tayini ve lenfoma ve lösemi ayiriminda
? Hücre içi antijenlerin (myeloperoksidaz miktari) tayini
? Hematopoetik hücrelerin (CD4)
? Hematopoetik olmayan
? Tümörler ve hücrelerden ayirt edilmesi
62. DNA analizi
? Anöploidi tayini
? Hücre siklüsu kinetiginin belirlenmesi
? Apoptozis
Nötrofil fonksiyon analizleri
? O2’nin olusumunun tayini ile;
? Granulomatoz hastalik tayini
Diger kullanim alanlari
? Retikülosit sayimi
? Transplant hastalarinda Cross-Match
? Sitogenetik
63. ENFEKSIYON HASTALIKLARINDA
? Mikroorganizma- hedef hücre iliskisi;
? Apoptozisin incelenmesi
? HIV ile enfekte kisilerde
? Monunükleer hücrelerinde apoptosis oranlari
? CD8 T ve
? CD19 B hücrelerinde en siktir
? Konak hücreye ait proteinlerdeki degisimler
EBV ile enfekte B lenfositlerinde;
? BCR2 ekpresyonu
HIV ile enfekte T lenfositlerinde;
? CD4 ekpresyonu
CMV ile fibroblastlarda;
? MHC I ekpresyonu
64.
? Mikroorganizmanin hücreye baglanmasinin incelenebilmesi
? EBV’nin
? B lenfositlerine
? Epitel hücrelerine
? CR2 reseptörüne
? Poliovirus
? MNH CD14 reseptörlerinde
? Kizamik virusu
? Hedef hücrelerin CD46 reseptöründe
? Hücre içi ve yüzeyi mikroorganizma antijenlerini inceleme
? VZV ile enfekte hücre yüzeyinde
? gp1
? HIV ile enfekte CD4 T lenfositlerinde
? gp 160/120
? Influenzae ile enfekte hücrelerde
? HA antijenileri
65.
? Klinik virolojide kullanilmaktadir
? Enfekte kisilerin hücrelerinden
? Virusle enfekte olanlari süratle belirler
? CMV ile enfekte MNH’ler kantitatif olarak
? HIV seropozitif kisilerde
? MNH’ lerde kantitatif Ag tayini ? Böylelikle;
*Antiviral tedavinin izlemi
? Spesifik antikor tayini
? CMV, HSV, HIV gibi viruslara
? H. pylori gibi bakterilere
? T.gondii gibi parazitlere karsi
? Gelisen spesifik Ab’ler ölçülebilir
66. 2-LENFOSIT SAYIMI VE AKTIVASYON TESTLERI a) Lenfosit izolasyonu
Dansite- Gradient Santrifüj Yöntemi
? Kan hücre gruplari birbirinden farkli dansite özelligine sahiptir
? 3 ml ficol-isopak (Dansite 1077 gr/lt) konur
? 3 ml heparinli periferik kan konur
? 1500 devirde, 45 dakika santrifüj edilir
? Lenfositler orta tabakada yogunlasirlar
? En altta eritrosit ve granülositler
? Dansiteleri 1077 ‘den fazla
? En üstte buff-coat toplanir
? Dansiteleri 1077’den düsük
? Buff- Coat’dan
? Trombositler (santrifüj)
? Monositler petri kabinda tutularak uzaklastirilir
67. b) Lenfosit ayirimi
T lenfosit ayirimi
? Rozet testi
? Koyun eritrositlerine karsi CD2 reseptörü vardir
? Periferik kanda E-Rozet yapan
? %65-70 T lenfosit vardir
? B lenfositi E-Rozet yapmaz
68. B lenfosit ayirimi
? Direkt immun fluoresan yöntemi
? Fluoresanlanmis (FITC) anti- Ig Ab ile yapilir
? Toplam lenfositlerin %20-25’i B lenfositleridir
Periferik kandaki
? T ve B lenfosit oranini saptamak
?Immun yetmezlik hastaliklarinin tanisinda
?Lenfosit lösemi ve lenfomadaki lenfosit tipinin tayininde
?Otoimmun hastaliklar ve kanserli olgularda hücresel immun yanitin degerlendirilmesinde kullanilir
69.
NK sitotoksisite ölçümü
? Antikora bagimli hücresel sitotoksisite ölçümü
? CR 51 ile isaretlenmis ve yikanmis hedef hücrelere
?Anti- hedef hücre Ig G ile
? FcR bulunan effektör hücreler (NK, makrofajlar) eklenir
? Hedef hücrelerden CR 51 salinir
? Gamma sayacinda CR 51 ölçülür
? CR 51 miktari,
? NK hücre sayi ve aktivite düzeyi ile dogru orantilidir
70. c) Lenfosit Aktivasyon testleri(LAT) Lenfosit uyarimi
? Otoimmunite
? Kanser patogenezinde
? Intraselüler enfeksiyonlarda
? Hücresel immun yanitin ölçümünde uygulanmaktadir
Genelde T hücre bazen B hücre yaniti degerlendirilir
Aktive olan T hücreleri
? Morfolojik ve fenotipik degisiklige ugrarlar
? Büyüklügü degisir
? Histolojik boyamada kromatik degisiklik
? Dinlenme halinde olmayan
? Ancak; aktive oldugunda ortaya çikan yüzey proteinleri meydana gelir
71. LAT;
? Hasta lenfositlerinin
? Özgül antijenle
? Veya özgül olmayan antijenlerle
? Invitro uyarilmasina dayanir
? Iki tipi vardir
1)Yüzey fenotipi (aktivasyon belirteçleri) degisikliklerini belirlemek
? Aktivasyon belirteçleri
? Ya enflamasyon bölgesinden direkt hücrelerden
? Ya da invitro uyarilan lenfositlerden aranir
? FLOWSITOMETRI ile belirlenir
72. 2) Uyari sonrasi lenfositin proliferasyon yetenegini ölçmek
? Lenfoblast transformasyon testi (LTT)
? 96 kuyucuklu plaklarda yapilir
? T hücre uyaranlari olarak
? Fitohemaglutin (PHA)
? Konkovalin A (ConA)gibi lektinlerle
? Süperantijenler gibi bakteriyel toksinlerle
? B hücre uyaranlari olarak,
? Süperantijenler
? LPS kullanilir
73. LTT TESTINDE;
? Antijen ve lenfositlerin 72 saat kültürü yapilir
? H timidin eklenir
? H timidin çogalan DNA yapisina girer
? Radyoaktif veya fluoresan boya ile
? DNA sentez hizi ve miktari ölçülür
? Hasta ve kontrol karsilastirmalari ile yorumlanir
74. ? Karisik lenfosit kültürü
? Alici ve verici kanindan ayrilan lenfositler
? Invitro besiyerinde karistirilarak
? Lenfosit kültürü yapilir
? Antijenik farklilik varsa
? Biri digerini aktive eder
? Blastik dönüsümle DNA miktari artar
? DNA sentezinin kantitatif ölçümü yapilir
? Bazen verici lenfositleri
? X isinlari ile isleme sokulur
? Blastik dönüsüm olmaz
? Alicinin lenfositleri uyarilir
? Alicinin verilecek Dokuya karsi reaksiyon ölçülür
? Buna tek yönlü karisik lenfosit kültürü denir
? Doku transplantasyonunda
* HLA- D (LD antijenleri) antijenleri saptanir
? Sitolitik T hücre yanitinin degerlendirilmesinde
75. ? Lenfositotoksik test
? Test prosedürü
? HLA antijeni saptanacak total lenfositler veya CD 19 B lenfosit
? Hangi HLA’ya ait oldugu bilinen anti-serum
? Kompleman
? Tripan mavisi veya eozin boyasi
? Antijen + antikor birlesir
? Kompleman baglanir
? Lenfosit zari zedelenir
? Boya lenfosit içine girer
? Mikroskopta %50’den fazla boyanan lenfosit miktari
? Denenen lenfositleri, bilinen anti- HLA tipine ait oldugunu gösterir
? Doku transplantasyonunda
* HLA A,B,C antijenlerin göstermede kullanilir
76.
Sitokin sentezini belirleme testleri
? Aktive T hücreler degisik sitokinler üretirler
? Enflamasyon bölgesinden elde edilen T lenfositler
? Invitro kültürü yapilir
? Total sitokin sentezini verir
? ELISPOT (Enzimle isaretli immunspot)
? Belirli T hücre grubunun ürettigi sitokini yüzde olarak belirler
? Flowsitometrik yöntemle
? Tüm farkli sitokin sentezleri ölçülebilir
77. 3- MONOSIT/MAKROFAJ TESTLERI M/M Hücreleri
Dogal bagisiklikta rol alirlar
? Ve özgül bagisikligi sitokinlerle koordine ederler
Spesifik patojenleri yok eden efektör hücrelerdir
Apoptosizde apoptotik hücreleri temizlerler
? Bu hücreler doku örnekleri yada hücre süspansiyonlarindan MAbs ile saptanirlar
? Monositin en iyi belirlenmesi;
? FLOWSITOMETRIDE
? Anti, CD14 mAbs ile olur
? Ayrica CD11b, CD11c, CD16, CD32, CD64 gibi tasidiklari reseptörlerle tanimlanmalari yapilir
? Histokimyasal boyama olarak
? Non spesifik esteraz Boyamasi
? Monositer lösemi tanisinda kullanilir
78. MAKROFAJ GÖÇÜNÜ ÖNLENIM TESTI Duyarli lenfosit ile antijen temasi sonucu
? Salgilanan MIF (Makrofaj göçünü önleyen faktör)
? Saptama testidir
? Kapiller tüpte
? Lenfosit
? Özgün antijen varsa MIF pozitiftir
? MIF TESTININ POZITIFLIGI
? O antijene karsi hücresel immun yaniti gösterir
79. 4-NÖTROFIL FONKSIYON TESTLERI Polimorf nüveli nötrofiller (PMN)
? Dogal immunitenin efektör (fagositik) hücreleridirler
? Enflamasyon bölgesine ilk gelen hücrelerdir
? PMN yetersizligi
? Ya PMN sayisal azligi
? Yada PMN fonksiyon bozuklugu seklinde olabilir
? Bakteriyel enfeksiyonlara yatkinlik saglar
? Yetersizlik ölçüm testleri;
Nötrofil sayisal degerlendirmesi testleri
Nötrofil adhezyon degerlendirme testleri
Kemotaksi degerlendirme testleri
Opsonizasyon degerlendirme testleri
Fagositoz yapmayi saptama testleri
Oksidatif patlama ve degranülasyon degerlendirmesi
Bakteriyel öldürmeyi degerlendirme testleri
olarak siniflandirilir
80. a)Nötrofil sayisi Nötropeni
? 500/ml kanda olmasi
? Kemik iligi, malignite, otoimmunite ve kemoterapiye bagli gelisir
? Mikroskobik boyama yöntemleri
? Gelismis hematoloji ve immuno hemotoloji cihazlariyla saptanir
? FLOWSITOMETRI
81. b) Kemotaksi(KT) testleri Nötrofillerin
? Enflamasyon bölgesine hareketine (migrasyonu) KT denir
? Bakteri ürünleri (endotoksin, hücre duvar yapilari, bakteri enzimleri)
? Konak faktörleri (C3a ve C5a, LTB4) rol oynar
? Bu kemotaktik moleküllere yanitsizlik;
? Defektif migrasyon (göç) yaniti ile sonuçlanir
? Defektif göçü saptamada
? BOYDEN odacik testi kullanilir
? Filtre üzerinde;
? Kemotaktik madde
? Nötrofillerle yapilir
? Petride agaroz jelde;
? Kemotaktik maddeler
? Nötrofillerle yapilir
? Kemotaksi testleri
? Idyopatik immun yetersizlik hastaliklarinin tanisinda kullanilir
82. c) Nötrofil adhezyonu NÖTROFILLERIN
Endotele adhezyonu ve enflamasyon bölgesine göçü
? L-selectin ve Integrinle saglanir
? Bu iki adezindeki yetersizlige
? Lökosit adhezyonu yetersizligi (LAY) denir
? Bu durumda;
? Nötrofil enflamasyon bölgesine ulasamaz
? Bakteriyel enfeksiyon yayilir
? Abse olusmaz
LAY hastalarinda
? CD11a/CD 18a LFA-1 (lenfosit fonksiyon antijen-1) lökosit integrini yoktur
? Mabs’lerle FLOWSITOMETRI ile belirlenir
83. d) Opsonizasyon testleri OPSONIN
Mikroorganizmalarin fagositlere baglanmasini saglayarak fagositozu kolaylastiran moleküllere denir
? IgG1,3 ve IgM, C3b ve iC3b’dir
? Opsoninler için
? Nötrofillerde
? Fc?R III (IgG ve IgM)
? CR1 ve CR3 (C3b ve iC3b)
? Makrofajlarda
? Fc?R I,II,III (IgG ve IgM) reseptörleri bulunur
84. OPSONOSITOFAJIK TEST
? I-tüpe
? Norm serum + norm lök + kuskulu bakteri
? II-tüpe
? Immun (hasta) serum + norm lök + kuskulu bakteri
? 37ºC’de 20 dakika inkübasyon
? Her iki tüpden ayri preparat hazirlanir
? May –Grunwald – Giemsa boyama
? Lökositlerin içine girmis bakteri sayilir
? Normal serumda ve immun serumda
? Ayri sayilan bakterilerin toplami
? Sayilan lökosit sayisina bölünür
? Bir lökosite düsen bakteri sayisi bulunur
? Buna fagositoz endeksi (FE) denir
? IS/NS orani OPSONIK ENDEKSI’ni verir
? Oranin büyüklügü IS’deki Ab titresi ile orantilidir
85. ERITROSIT –AMBOSEPTÖR-KOMPLEMAN(EAC) TESTI
? Kompleman C3b parçasina karsi
? Nötrofillerde bulunan reseptörlerin belirlenme testine denir
? Koyun eritrositleri
? Özgül antikorlari ile birlesir
? Kompleman baglarlar
? Hemoliz olusur
? Kompleman C5 parçasi eksik olarak deneye sokulursa
? E+Ab/C kompleksi
? C3b reseptörlü nötrofillerle rozet yaparlar
86. e) Fagositoz Mikrobiyal öldürmenin ilk basamagidir
Antikor ve komplemanla opsonize mikroorganizmanin
? PMN ve makrofajlarla temasindan sonra
? Içeriye alinma islemidir
Fagositoz testleri
? Opsonize partiküller ile
? Nötrofillerin inkübasyonu sonucu
? Mikroskopta partikülleri içine alan
? Nötrofiller görülür
? Opsonize olmus
? Ancak hücre içine alinmamis partiküller
? Asit muamelesi ile uzaklastirilirlar
? Fluoresan veya radyoaktif madde ile isaretlenirler
? Direkt sayimlari yapilir
87. f) Oksidatif patlama ve degranülasyonun degerlendirilmesi I- Oksidatif patlamaya yönelik
Nötrofillerin fonksiyonun degerlendirilmesinde
? En sik uygulanan test
? Süperoksit sentez yeteneginin degerlendirilmesidir
Kronik granülomatöz hastaligin taramasinda
? Bu degerlendirme kullanilir
? ÇÜNKÜ;
? Bu hastalik fagositoz defekti sonucu gelisir
? Nötrofil içinde NADPH’i (nikotin amid adenin di nükleotid fosfat de hidro genaz) etkileyen oksidaz enzimdeki bozukluktur
88. Dört test yöntemi kullanilir
1)NBT (Nitroblue tetrazolium test)
Testin prensibi
? NBT’ in redüksiyonuna dayanan bir testtir
? Redükte oldugunda sari renkten koyu mora dönüsür
? Nötrofiller;
? NBT içinde 37 ºC’ de 15 dakika tutulur
? NBT, nötrofil içine alinir
? Pyridine ile ekstrakte edilir
? 515 nm dalga boyunda spektrofotometrede okunur
? Veya mikroskopta boyanarak görülebilir
89.
Testin degerlendirilmesi
? Nötrofiller içinde süperoksit ve H2O2 olusur
? Bunlarin redüktan etkisiyle
? NBT redükte olur (renk degisir)
? Öldürme islemi oldugunu gösterir
90.
Lökositlerin mikroorganizmalari öldürme islemi bozuk olan hastaliklarda
? Kronik granülamatöz hastalik
? Chediak- Higashi sendromu
? Myeloperoksidaz yetmezligi olanlar
? Glukoz- 6 fosfat dehidrogenaz eksikligi olanlarda
? Akut lösemi
? Down sendromu
? Akut enfeksiyonu olanlarda
? NBT negatiftir
91. 2)Sitokrom b ölçülmesi
¦ Fagositlerde bulunan;
? Oksidaz enziminin parçasi olan sitokrom –b’ nin
? Immunolojik cihazlar
? Ve biokimyasal yöntemlerle ölçülmesidir
3) Flowsitometrik , DCF (dichlorofluoresan) yöntemi
¦ Bu test H2O2 olusumunu ölçer
¦ Kronik granülomatoz hastaligin tanisinda kesin sonuç verir
4)Kemülimunisans’a Dayali immuno hematolojik cihazlar
¦ H2O2, O-, O2 radikallerini ölçmeye dayanir
92. II- Degranülasyona dayali testler Degranülasyon
? Fagozom ve lizozomlarin füzyonu sonucunda
? Fagolizozomun içine lizozom içeriginin bosalmasidir
ELISA yöntemiyle
? Lizozom içeriginin
? Asid hidroloz
? Lizozim
? Laktoferrin
? Katyonik proteinlerin ölçümü yapilir
93. III- Mikrobik öldürme Mikrobisidal test
? Hasta ve kontrol grubundan nötrofiller alinir
? Hastalardan izole edilen bakteri ve mantar ile kültürü yapilir
? Bir gece beklenir
? Ertesi gün yasayan bakteri veya mantar yoksa mikrobik öldürme tamdir
94. B)INVIVO TEST YÖNTEMLERI DERI TESTLERI;
Geç asiri duyarlilik reaksiyonunu ölçerek
? Hücresel bagisik yanitin degerlendirmesini
? Belirli bir patojeni veya temas antijenini taniyan bellekli T lenf varligini saptar
? Test pozitifligi ancak klinik öyküyle anlamlidir
En sik uygulanan model
? Intraselüler bakteri enfeksiyonlarinda
? Tüberkülin deri testi olarak
? Old tüberkülin(OT)
? 1890 yilinda R.Koch buldu
? PPD( purified protein derivide) uygulanir
? Saybert ve Glen 1941 yilinda tanimladilar
? PPD-s olarak standardize edildi
? 1-TÜ : 0.00002 mgr PPD-s içerir
? M.tuberculosis enfeksiyonlarinin tanisinda kullanilir
95. AYRICA;
? Blastomisin (blastomikoz)
? Histoplazmin (histoplazmoz)
? Brucellin (bruselloz)
? Frei testi (LGV)
? Toksoplazmin (toksoplazmoz)
? Ekinokokkin(ekinokokkoz)
? Deri testleride kullanilir
Bunlarin disinda;
? Kontak duyarliliginda ilaç, metal, bitkisel maddelere karsi
? Dermatit tanisinda panel antijenler kullanilir
? Prausnitz-Küstner (PK) reaksiyonu
? Atopik allerjili bir serum ve spesifik antijenin
? Diger bir kisinin deri içine verilmesiyle
? Anafilaksinin pasif transferi gösterilir
96. TÜBERKÜLIN DERI TESTI PPD;
Montoux deri içi uygulamasi ile yapilir
? 5 T U (0.1ml) ön kol iç yüzeyinin deri içine
? 48 -72 saat sonra endurasyon degerlendirilir
? Endurasyonu (Sertligi);
? =10 mm olan,
? BCG olmamis çocuk ve yetiskinlerde
? Pozitifligi gösterir
? = 15 mm olan
? BCG’li çocuklarda pozitifligi gösterir
? 5-10 mm arasi
? BCG asilanmasina
? Atipiklerle çapraz reaksiyona
? Anerjiye bagli olarak görülür
Pozitif deri testinin anlamli olmasi için;
? Klinik belirtilerden önce negatif daha sonra pozitif olmasi gerekir
98. Deri testinde teknik hatalar
¦ Uygunsuz antijen konsantrasyonu
¦ Enjeksiyonun cildin derinine yapilmasi
¦ Subjektif degerlendirme
¦ Test yerine dissal müdahaleler
¦ Booster olayi gelisebilir
? Yasla
? BCG asilamasi
? M.tuberculosis ve atipiklere karsi olusan asiri duyarlilik
? Booster’i artirir
99. IV- IMMUNO GENETIK YÖNTEMLER Nükleik asit teknolojisine (NAT) dayali test yöntemleri
? Klinik immunoloji laboratuvarinda daha yenidirler
? Konvansiyonel yöntemlerin yerini ne kadar alacaklari zamanla görülecektir
? ANCAK;
? Enfeksiyon hastaliklarinin taniminda
? Etkenlere yönelik DNA ve RNA saptanmasi
? Siklikla yer almaktadir
100. NAT’a dayali test yöntemleri
1)Hibridizasyon (birlesme)
2)Amplikasyon (çogaltma)
basliklari altinda incelenir
101. 1)HIBRIDIZASYON Bir DNA molekülü
? Kompementerlik (birbirinin tamamlayicisi) özelligindedir
? Isi ya çesitli kimyasal maddelerle ayrilabilen
? Uygun isi, tuz konsantrasyonu, PH’da yeniden birlesebilen
? Iki sarmal zincire sahiptir
Iste tani amaciyla nükleik asitlerin arastirilmasi
? Molekülün bu özelliklerine dayanmaktadir
102. YÖNTEMIN PRENSIBI Klinik örnekte varsayilan etkenin nükleik asidi isi ve kimyasal maddelerle iki zincire ayrilir
Bu zincirlerin varligi PROB adi verilen isaretli DNA ve RNA parçasiyla gösterilmektedir
PROB adi verilen reaktiflerin isaretlenmesinde
? Flurokrom
? Enzim
? Kemülüminesan madde
? Radyoizotop kullanilmaktadir
PROBLAR
? Hedef nükleik asitlerin belirli bölgelerine komplementerdir
? 50 bp’den küçüktürler
103. HIBRIDIZASYON TEKNIKLERI
a)Sivi faz hibridizasyonu
Sivi ortamda prob ve hedef nükleik asit serbesttir
? DNA/DNA
? DNA/RNA
b)Kati faz hibridizasyonu
I-MAKROARRAY( makroskobik dizinleme) yöntemi
Nitro selüloz ve Naylon gibi porlu yüzeylerde yapilir
104. Southern blot
? DNA’lar;
?Agaroz jel elektroforezle, nitroselluloz ve naylon membran kagida aktarilir
? Restriksiyon enzimleri ile klinik örnek temas ettirilir
? DNA/DNA (32p-Biotin/Avidin peroksidaz)
? Nokta mutasyonlari, delesyonlar ve translokasyon sonucu farkliliklarin saptanmasiyla hematolojik malignitelerin özelliklerinin belirlenmesinde kullanilir
? Burkitt lenfoma, Foliküler lenfoma
? Kronik myeloid lösemi
? Philadelphia kromozomu
? AYRICA;
? B hücre lenfomalarinda
? B hücre klonizitesinin incelenmesinde
? T hücre lenfomasinda
? T hücre klonizitesinin incelenmesinde
? Nükleik asit boyutlari konusunda yardimci olur
105. Northern blot
? RNA’lar,
? Nitroseluloz kagitlara aktarilir
? mRNA /cDNA-cRNA hibridlemesinde
? 32p-Biotin/AP isaretlemesi kullanilir
Dot blot
? DNA’lar nitroselüloz kagitlarda
? DNA/DNA
? 32 p-Biotin/AP isaretlemesi kullanilir
106. II-MIKROARRAY
Porsuz yüzeyleriyle plastik, cam ve silikon kullanilir
Klinik örnekten
? Nükleik asidin pürifikasyonu
? Amplifikasyonu
? Hibridizasyonu
? Tespiti
? 25- 75 mm’lik slaytlarda yapilmaktadir
Uygulama alanlari
? Antimikrobiyal ilaç kesfi ve gelistirilmesi ile asi çalismalari
? Kanserlerin siniflandirmasi ve derecelendirmesinde
? Mikroorganizmalarin tespit, tani tiplendirme ve ilaç direncinde
? Konak bagisiklik sistemindeki polimorfizmler
107. c) In Situ Hibridizasyon Doku yada hücrelerdeki;
? Nükleik asitleri saptar
DNA/DNA hibridlemesinde;
? Biotin/AP isaretlemesi kullanilir
16S/23S r-RNA’lari hedefleyen
? Fluorokrom’la isaretleme olur
? FISH (flouresan inn situ hibridizasyon yöntemi)
Belirli genlerin;
? Kromosomal lokalizasyonunu haritalamak
? Veya kromozomal bozukluklarinin saptanmasinda kullanilir
108. Klinik Mikrobiyolojide Hibridizasyon Örnekleri FISH yöntemiyle
? 16 S ve 23 S r RNA hedeflenmesiyle patojen bakterilerin
? Filogenetik analizleri
? Tür, cins, aile, filum
? Patojen bakterilerin diret tespiti ve identifikasyonu
? Çevredeki ekosistemlerde ve karisik enfeksiyonlarda
? Mikrobiyal hücreleri ayirmada
? Yavas üreyen, kültürü zor bakterilerin
? Legionella
? Bordetella
? Mycobacterium
? Brucella vb hizli tani ve identifikasyonunda kullanilir
109. AYRICA;
HIBRIDIZASYON YÖNTEMIYLE;
? Genital örneklerde
? HPV-DNA
? Hepatit B’ li hastalarda
? HBV-DNA
? AIDS’li hastalarda
? HIV- RNA veya HIV proviral DNA
? Transplant hastalar ve kongenital enf
? CMV-DNA
? M.tuberculosis, N.gonorrhoeae, C.trachmatis vb bir çok bakterilerin moleküler tanisinda
? Pediatrik sepsis olgularinda kan patojenleri
? S.aureus
110. 2)NÜKLEIK ASIT AMPLIFIKASYONU (ÇOGALTMA)(NAA)
NAA yöntemleri
Hedef Amplifikasyon Sistemleri
Sinyal Amplifikasyon Sistemleri
adi altinda incelenmektedir
111. a) Hedef Amplifikasyon Sistemleri Incelenecek örnekteki az sayida hedef molekülün (DNA, RNA)
? Invitro enzimatik replikasyon yöntemleriyle
? Saptanabilecek düzeylere çikarilmasidir
112. Yöntemler PCR
? Klinik örnekte DNA araniyorsa
? 4 adet deoksinükleik trifosfat (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)
? Özgül oligonükleotik primerleri (15-30 bazlik)
? Isiya dayanikli Tag polimeraz enzimi
? 94 ºC’de (denatürasyon)
? 54 ºC’de (baglama)
? 72 ºC’de (Genisleme)
? Bu islem 25-30 kez yapilir
? Southern hibridizasyonla tanimlama yapilir
? Klinik örnekte RNA araniyorsa
? RNA’nin elde edilmesinden sonra
? Revers-Transkriptaz uygulanarak
? cDNA’ya çevrilir
? Daha sonra cDNA amplifiye edilir
113. ? Degisik PCR tipleri
? Arbitrarily primer PCR(APP)
? Multiplex PCR(MP)
? Nested PCR(NP)
? RT-PCR(RTP)
? Kantitatif PCR(KP)
? Real time PCR(RTIP)
? En gelismis sistem
? Çogaltma ve tanimlama ayni anda ve tüpte
114. ? PCR’ IN KULLANIM ALANLARI
ÖZELLIKLE;
? Enfeksiyöz mikroorganizmalarin
? Saptanmasi
? Identifikasyonu
? Kantitasyonu
? Alt tip degerlendirmesi
? Bakterilerde antibiyotik direnci
? Enterokoklarda vankomisin direnci
(Van A,B,C)
? S.aureus’da mecA geni
115. ? Epidemiyolojik tiplendirmede (ayni kökenin iki tipi)
? Enfekte hastalarin antimikrobiyal tedavisini izlemede
? Insan ve kanser genotipi incelemelerinde
? DNA yapisindaki mutasyonlar
? Gen tayini ve dizilimi saptamasi
? Gen ve genetik polimorfizmi saptama
? Transkriptlerin özellikleri ve miktari saptanmasi
? Genetik manüpülasyonun saptanmasi
116. GENEL OLARAK; PCR
? Klinik ve Adli tip
? Immunoloji
? Mikrobiyoloji
? Epidemiyoloji
? Fizyoloji
? Ilaç ve asi çalismalari
? Veterinerlik
? Ziraat ve tarim
? Zooloji
alanlarinda kullanilmaktadir
117. DIGER YÖNTEMLER LCR(Ligaz Zincir Reaksiyonu)
SDA(Strant Displacement Amp-Zincir Yer Degistirme)
Transkripsiyon temelli Amplikasyon teknikleri
? Hedef molekülleri RNA’dir
? TAS( Transcription based Amp)
? TMA(Transcription mediated Amp)
? NASBA (Nükleik Asid Sequence based Amp)
? Northern blot ile tanimlama yapilir
118. b)Sinyal (Prob) Amplifikasyon sistemleri(SAS) Hedef Amplifikasyon tekniginin aksine
Bu sistemde
? Amplifiye edilen ve saptananlar
? Problar veya
? Hedef dizilime özgül
? bDNA (branced DNA)
? Hedef DNA
? bDNA probu ile hibridize edilir
? Bu proba özgün
? Alkali fosfatazla isaretli ek problar eklenir
? Substrat eklenir
? Luminimetrede okunur
? HBV, HCV, HIV-1 tayininde kullanilir
119. SAS’ ta Yöntemler olarak
? Direkt hibridizasyon yöntemi;
? Hibrid capture
? CMV, HBV, HPV
? N.gonorhoeae
? C.trachomatis
? CPT (döngü prob teknolojisi)
? MRSA’da Mec A geni
? M.tuberculosis’te gen dizilimleri
? VRE ’lerde VanA, Van B
? RCA (Rolling Circle Amp)
? Tek nükleotid polymorfizm
? Allellik ayriminda kullanilir
120. V-MAJOR HISTOCOMPATIBILITY COMPLEX (MHC) GEN BÖLGESINE YÖNELIK TESTLER MHC ve ÜRÜNLERI
? Insan 6. kromozom kisa kolunda yer alirlar
? Üç gen bölgesine sahiptirler
? MHC Sinif I gen bölgesi
? HLA-A,B,C,E,F,G antijenleri
? MHC Sinif II gen bölgesi
? HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP antijenleri
? MHC Sinif III gen bölgesi
? Hsp, TNFa, C4A,C4B, C2, Bf
121. ? HLA molekülleri
? Glikoprotein yapisindadirlar
? Transmembranöz yapida bulunurlar
? Yüksek polimorfizm (bireyden bireye) gösterirler
? HLA-I;
? En fazla lenfosit, lökosit olmak üzere
? Tüm çekirdekli somatik hücrelerin çogunda,
? Eritrositler hariç
? HLA-II ise;
? Sinir olup APC (dendritik hücre, makrofaj)
? B lenfositleri, Aktive T4 lenfositleri,
? Endotel, böbrek glomerül hücrelerde bulunur
122. HLA Doku tipi tayinindeki amaçlar Organ ve doku tipi nakillerinde, HLA uyumu
Adli tipta
? Babalik tayininde
? Kimlik tanimlamasinda
Bazi otoimmun hastaliklarin tanisinda
? HLA-B 27 ile ankilozan spondilit
? HLA-B 51 ile behçet hastaligi
123. HLA Doku Tipi Tayin Yöntemleri Üç grup altinda yapilmaktadir
1)Antikor Temelli Yöntemler
2)DNA Temelli Yöntemler
3)Hücre Temelli Yöntemler
124. 1)Antikor Temelli (Serolojik)Yöntemler a) Mikrolenfositotoksisite yöntemi
Hücre yüzeyindeki HLA-I özellikle ve HLA-II antijenik saptamada
Terasaki plaklarinda yapilir
? Hangi HLA antijene özgül oldugu bilinen bagisik serum
? Çukurcuga antijen tipi tayin edilecek lenfositler
? Kompleman konur
? Inhibitör olarak eozin boya maddesi eklenir
? Ag ve Ab birlesirse
? Kompleman baglanir
? Lenfosit zari tahrip olur
? Boya içeriye girer
DEGERLENDIRMEDE;
? Kuyucuktaki lenfositlerin çogunun boyanmis olmasi
? O lenfositlerin özgül antikora özgül antijen olduklarini gösterir
125. b) Sandwich ELISA yöntemi HLA-1 ve özellikle HLA-2 antikor tayini için yapilir
? Plaklarda solid fazda bilinen HLA antijeni
? Üzerine hasta serumu (aranan ab)
? Konjugat
? Substrat
126. c)Lenfosit Cross-Match Yöntemi Doku- organ alicisinda vericinin HLA antijenlerine karsi antikor olup olmadigini saptamak için
? Özel plaklarda çukurlara alicinin serumuna
? Vericinin lenfositleri ilave edilir
? Kompleman ilave edilir
? Eozin boyama(indikatör)
? Alicinin serumunda Ab varsa
? Lenfositlerle birlesir
? Kompleman ikisine baglanir
? Lenfosit zari zarar görür
? Boya lenfositlerin içine girer
DEGERLENDIRME;
? Boya maddeleri lenfosit çukurcukta fazla ise
? Hasta serumunda antikor vardir
127. 2)DNA temelli yöntemler PCR yöntemi
MHC gen bölgesinde;
? Sekansa spesifik Primerleri (SSP) kullanarak
? HLA-I ve II tiplemesi yapilir
MHC gen bölgesinde
? Sekansa spesifik oligonükleotid (SSO) prob hibridizasyonu ile
? HLA-I ve II tayini
Her iki yöntem sonrasi;
? Restriction fragments lenght polymorfizm (RFLP)
? Uygalanarak DNA parçalara ayrilarak spesifik problarla tanimlanir
128. Sekanslama (dizi analiz) temelli HLA tiplemesi
? PCR ile çogaltilan HLA gen segmentinin
? SEKANS CIHAZINDA, nükleotid sekans (dizi analiz)yapilmaktadir
129. 3) Hücre temelli yöntemler
KARISIK LENFOSIT KÜLTÜRÜ (mixed lymhocyte culture-MLC)
? HLA moleküllerinin allograft reddinde
? Hedef molekül olusturmasi esasina dayanarak tespit edilir
? HLA tiplemesinde kullanilir (özellikle HLA-D alt tipleri)
130. ? BU AMAÇLA;
? Alici ve verici lenfositleri karsilastirilarak
KARISIK LENFOSIT KÜLTÜRÜ (Mixed lymhocyte culture)
? Kültürde HLA’si bilinen uyarici lenfosit ile
? Yanit verecek ve HLA’si bilinmeyen lenfosit
? Kültür yapilir
? Antijenik farklilik varsa
? Uyari sonucunda yanit veren hücrede blastik dönüsümle mitoz olur
? DNA yapimindaki artis isaretli timidin ile ölçülür
? DNA sentezi kantitatif olarak ölçülür
? Antijenik benzerlik varsa
? Süreç çalismayacaktir
