Jacques Mainil Les souches entérohémorragiques d’Escherichia coli en médecine vétérinaire

1. Cours de bactériologie 2ème doctorat Service de BactériologieDépartement des Maladies infectieuses et parasitairesFaculté de Médecine Vétérinaire Jacques Mainil Les souches entérohémorragiques d’Escherichia coli en médecine vétérinaire

2. Pathogenic strains of Escherichia coli Acronyms Pathotypes (or virulotypes) EHEC Enterohaemorrhagic E. coli EPEC Enteropathogenic E. coli DHEC Diarrhea-associated Haemolytic E. coli ExPEC Extraintestinal E. coli UPEC Uropathogenic E. coli NMEC Neonatal Meningitis E. coli APEC Avian Pathogenic E. coli ETEC Enterotoxigenic E. coli VTEC Verocytotoxigenic E. coli CDEC Cell Detaching E. coli CDTEC Cytolethal Distending E. coli NTECNecrotoxigenic E. coli AEEC Attaching-Effacing E. coli EIEC Entero-invasive E. coli EAEC Enteroaggregative E. coli DAEC Diffusely-adherent E. coli

3. EPEC, VTEC and EHEC • Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) • strains producing attaching/effacing lesions (AE) • Verocytotoxigenic Escherichia coli (VTEC) • strains producing only Shiga toxins (Stx) • Enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) • strains producing Stx and AE lesion • similar to O157:H7 E. coli causing haemorrhagic enterocolitis

4. Shiga toxins • Production in the intestines • Crossing of the epithelium through the enterocytes • Reach the blood stream • Active in vivo on the endothelial cells of the blood vessels • Stop the protein synthesis in the target cells • Oedemas and haemorrhages Attaching/Effacing lesion • Attachment to the microvilli of the enterocytes • Injection of bacterial effectors into the enterocytes • Re- and dis-organization of the enterocyte cytoskeleton • Effacement of the microvilli of the enterocytes • Inflammatory reaction with cell infiltration, oedema of the mucosa and loosening of the tight junctions

5. - hommes Infection asymptomatique Entérocolite: diarrhée Entérocolite hémorragique: diarrhée abondante et hémorragique Syndrome hémolytique urémique Syndrome purpura thrombotique thrombocytopénique - bovins veaux (jusqu’à 3 mois): diarrhée adultes: portage asymptomatique - autres ruminants: portage asymptomatique - autres espèces : de manière anecdotique Pathologies des EHEC 5

6. Pathologies des EHEC 6

7. ? ? ? ? EHEC ? Epidemiology of EHEC EHEC young calves adult ruminants humans

8. Direct contacts ? ? Ruminants Humans Meat, milk Vegetables, fruits Faeces Swimming waters Intestinal content, faeces Dung, manure Soils Waters Drinking water Epidemiology of EHEC

9. Enterohemorrhagic [EHEC] /Verotoxigenic [VTEC]Escherichia colien production primaire Dr Hein Imberechts Laboratoire Nationale de Référence pour les E. coli zoonotiques, santé animale

10. Contenu • Définitions • Clinique • Virulence des VTEC • VTEC chez les ruminants • Le diagnostic • Programmes officiels, monitoring • Mesures • Portage de VTEC en Belgique et en Europe

11. Définitions • VTEC: produisent vérocytotoxines (VT), ou « Shiga toxins » (Stx) [voir Shigella dysenteriae] • EHEC • VTEC considéré très pathogène pour l’homme • Mais: pas toujours HUS, HC (maladie grave)

12. Définitions • E. coli O157 • Non-O157: e.a. O26, O91, O103, O111, O145 • Typique – atypique: réfère à la production des lésions A/E et (ou) la présence du plasmide EHEC • E. coli zoonotiques - autres VTEC • Problème de diagnostic

13. Clinique • UE: 1.2 cas par 100.000 habitants (EFSA, 2005) • Infection • Aliments contaminés • Eaux • Contact direct & indirect: ruminants infectés • Contact avec personnes infectées • Clinique • HUS, HC, BD • Diarrhée, mal de ventre, sans symptômes

14. Virulence • Facteurs de virulence • Toxines Stx1, Stx2 • Adhésines Eae • Locus of Enterocyte Effacement • Plasmide, Ehx (marqueur de virulence) • Autres

15. Virulence LEE locus Nataro and Kaper 1998

16. Virulence • Stx: encodé par phage, donc pas stable • Variants

17. Virulence • Séropathotype: combination de sérotype, stx subtypes, présence des facteurs de virulence et association avec maladie chez l’homme • Seropathotype A strains (VTEC O157) have a high relative incidence, commonly cause outbreaks and are associated with HUS • Seropathotype B strains (O26:H11, O103:H2/NM, O111:NM, O145:NM, O121:H19) have a moderate incidence and are uncommon in outbreaks, but were associated with HUS • Seropathotype C strains (O91, O104 and O113 all of H-type 21) are associated with HUS, but these strains were of low incidence and rarely caused outbreaks • Seropathotypes D and E are not HUS-associated and are uncommon in man or found only in non-human sources

18. Virulence • « Deux lignées » de VTEC O157; une plus associée avec maladie chez l’homme • Variants de Stx & pathologie • Conclusion: à l’heure actuelle, on ne peut pas identifier une souche pathogène pour l’homme

19. VTEC chez les ruminants • VTEC et diarrhée • Souvent stx1 • VTEC sans signes cliniques • Implications pour le diagnostic et le monitoring

20. Le diagnostic • Isolement E. coli O157 • mTSB+novobiocine; IMS (DynaBeads); CT-SMAC; agglutination • Cefixime Tellurite Sorbitol MacConkey • Méthode normalisée et validée (ISO 16654) • Autres • En développement • Détection moléculaire: gènes appartenant à plusieurs souches

21. Le diagnostic • Confirmation par sérotypie • Antigène O: LPS, sucres • Antigène H: flagelles, protéines • Agglutination • Confirmation par biochimie (O157) • b-glucoronidase (négative) • Sorbitol (fermentation lente)

22. Le diagnostic • Confirmation par PCR • Gènes: facteurs de virulence • Polymorphismes • Vérotoxines Stx1, Stx2 • Adhésine Eae (a, b, g, …) • Protéines du LEE • Typage (tracing) • PFGE: génome • Stx1, Stx2 • Phage

23. Le diagnostic • Tests sérologiques (ELISA) • Anti-O157 • Anti-Stx • Anti-Eae

24. Programme … • … officiel en production primaire • Il n’y en a plus depuis 2005 • Avant 2005 • Détection à l’abattoir • Tracing back de la ferme d’origine (Sanitel) • Echantillonnage • 20% entre 6 mois et 2 ans, aliment, poussière • PCR • Mesures d’hygiène sur la ferme

25. Programme • Site de colonisation ? • Echantillonnage spécifique ? • En fonction de • la nourriture • la saison • … • Plusieurs souches sur une exploitation

26. Monitoring • Données comparables ? Evolution ? • Infections chez l’homme & détection de VTEC pathogènes: • la population animale • les carcasses et viande à l’abattoir • les échantillons environnementaux qui peuvent être contaminés par matière fécale et eaux • ready to eat foods qui peuvent être contaminés par matières fécales • Sérotypes: E. coli O157, O26, O91, O103, O111 et O145

27. Monitoring • Recommandation EFSA • Caractériser toute VTEC (animaux, aliments, environnement), par méthodes harmonisées • Sérotypage • Lysotypie (VTEC O157) • Typage gènes vtx et eae • Typage moléculaire • PFGE • Collection centralisée et comparaison des résultats

28. Monitoring chez les animaux • L’isolement de VTEC indique la présence ubiquitaire dans l’environnement • Bovins > moutons & chèvres > animaux de compagnie, faune sauvage, … >>> porc, volaille, … • Tenir compte des différences locales • La population • Les pratiques agricoles • La consommation alimentaire, …

29. Monitoring chez les animaux • Problème: l’excrétion de VTEC O157 • Transitoire • Différences quantitatives • Influencée par l’âge et l’alimentation • Monitoring est lourd et cher • Utile en cas de risque, p.ex. ferme ouverte au grand public

30. Mesures • GHP à l’abattoir et à l’atelier de découpe, monitoring pour indicateurs comme Enterobacteriaceae et E. coli • Procédures HACCP pour aliments susceptibles à être contaminés • Monitoring des bovins, de la ferme, de l’aliment en cas d’études spécifiques • Recommandation: d’abord E. coli O157, puis d’autres sérotypes, avec des méthodes harmonisées

31. Portage de VTEC • EFSA: zoonoses, BIOHAZ • http://www.efsa.europa.eu/EFSA/ • Enternet • http://www.hpa.org.uk/hpa/inter/enter-net_menu.htm • PubMed • http://www.promedmail.org/ • AFSCA, Zoonotic agents in BE • http://www.favv.be/home/pub/doc07/Report_TS_2005_S.pdf

32. Portage de VTEC • Belgique • Peu de données, sauf aux abattoirs • Europe • Chiffres sont confus

33. Escherichia colientéro-hémorragique chez l’homme Christiane Duchesnes Janvier 2008

34. Escherichia coli Pathotype: EHEC Sérotypes: O157:H7; le plus fréquent O26, O103, O111, 0145, … Facteurs de virulence adhésion aux entérocytes et effacement des microvillosités sécrétion de toxines: Stx1 et Stx2 Réservoir Tube digestif de l’homme et de l’animal (ruminants) Contamination Ingestion: aliments contaminés par MF, crus ou peu cuits (hamburgers, produits à base de lait cru, légumes, …) Incidence Varie selon le pays; <2 cas/100 000 hab/an

35. Physiopathologie www.cdc.gov/ncidod/eid/vol8no5/01-0385.htm. Diarrhée séro-sanglante Tube digestif EHEC Toxine Microangiopathies (surtout rénales)

36. Tableau clinique Tableau clinique Diarrhée sérosanglante Colite hémorragique Douleurs abdominales Peu de fièvre Cas groupés souvent liés à la restauration rapide

37. Traitement Réhydratation Antibiotiques à éviter Complications Risques ++: enfants <3ans; adultes de >65 ans 10% Syndrome Hémolyse-Urémie (SHU) (incidence: 0,5 cas/100000 enfants<15ans /an) Rare Purpura thrombotique thrombocytopénique (PTT)

38. SHU (= HUS) MICROANGIOPATHIE (lésions endothéliales) • INFLAMMATION • Fragmentation des GR dans les lésions: anémie hémolytique • Hb basse, réticulocytes et schizocytes • Pâleur, (sub)ictère • MICROTHROMBI • Thrombopénie par consommation, pétéchies, purpura • INSUFFISANCE RENALE AIGUË • Oligo-anurie, oedèmes, prise de poids, hypertension artérielle, urémie

39. SHU traitement Symptomatique: Dialyse péritonéale SHU évolution ¾ cas évoluent vers la guérison < 5% mortalité Séquelles possibles: IRC HTA

40. Evaluation du risque lié aux VTEC et E. coli O157 entérohémorragiquesdans les aliments en Belgique Georges Daube Université de Liège Faculté de Médecine Vétérinaire Microbiologie des Denrées Alimentaires Sart-Tilman, bât. B43bis 4000 Liège tél. 04-366.40.15 fax 04-366.40.44 http://www.mdaoa.ulg.ac.be/ Georges.Daube@ulg.ac.be Avec l’aide de : Katelijne Dierick, ISP

41. Plan de l’exposé • Introduction • Evaluation des risques • Méthodes de recherche dans les aliments • Appréciation du risque dans la filière « viande » • Identification du danger • Evaluation de l’exposition • Caractérisation du danger • Caractérisation du risque • Mesures de prévention dans la filière « viande » • Problématique des critères microbiologiques • Conclusions

42. Analyse des risques Evaluation des risques Evaluation scientifique de la probabilité d’occurrence et de la gravité d’effets néfastes pour la santé résultant de l’exposition de l’homme à des dangers présents dans les aliments. Evaluation des risquespartie intégrante de l’analyse des risques Evaluation des risques Gestion des risques 1. Identification du danger 2. Evaluation de l’exposition Communication des risques 3. Caractérisation du danger 4. Caractérisation du risque

43. Principes des méthodes de recherche Pas de méthodes simples, standardisées et validées pour la recherche de VTEC non-O157 dans les aliments d’où pas de statistiques exploitables Aucune méthode disponible pour les dénombrements Pistes envisagées (recherches en cours) • séparation immuno-magnétique basée sur le sérotype • Besoin de milieux d’isolements spécifiques • Besoin de confirmer la virulence

44. Principes des méthodes de recherche Propriétés biochimiques des E. coli O157:H7 semblables aux autres E. coli excepté: • Résiste au tellurite et au céfixime • Ne fermente pas le sorbitol en 24 h • Ne produit pas de β-glucuronidase La sélection et la différentiation biochimique sont basées sur ces caractéristiques

45. Méthode-type de recherche de VTEC O157 dans les aliments • Préenrichissement  • Enrichissement  • (Détection immunologique) • Immuno-concentration (VIDAS ICE ou IMS-Dynal) • Isolement • Identification biochimique • Agglutination • Confirmation des facteurs de virulence par PCR

46. Schéma - Méthode Vidas ECO (1)

47. Schéma - Méthode Vidas ECO (2)

48. Concentration d’E. coli O157 par capture par des billes immunomagnétiques

49. Schéma - Méthode Vidas ECO (3)Confirmation

50. Centre de référence: UZ-BrusselsDr. Denis Pierard • Détection des gènes codants pour les facteurs de virulence - Vérocytotoxines (shigatoxines stx1 et 2) - Entérohémolysine - eaeA (intimine)