1 / 34

IZOLACIJA VIRUSA U KULTURI ĆELIJA

IZOLACIJA VIRUSA U KULTURI ĆELIJA. INSTITUT ZA JAVNO ZDRAVLJE VOJVODINE PROF.DR IVANA HRNJAKOVIĆ CVJETKOVIĆ. IZOLACIJA VIRUSA. IZOLACIJA VIRUSA JE UMNOŽAVANJE VIRUSA U ŽIVOM SISTEMU I NJEGOVO IZDVAJANJE ŽIVI SISTEMI SU: 1.KULTURA ĆELIJA

oriel
Download Presentation

IZOLACIJA VIRUSA U KULTURI ĆELIJA

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. IZOLACIJA VIRUSA U KULTURI ĆELIJA INSTITUT ZA JAVNO ZDRAVLJE VOJVODINE PROF.DR IVANA HRNJAKOVIĆ CVJETKOVIĆ

  2. IZOLACIJA VIRUSA • IZOLACIJA VIRUSA JE UMNOŽAVANJE VIRUSA U ŽIVOM SISTEMU I NJEGOVO IZDVAJANJE • ŽIVI SISTEMI SU: 1.KULTURA ĆELIJA • 2.OPLOĐENA KOKOŠIJA JAJA • 3.LABORATORIJSKE ŽIVOTINJE

  3. Izolacija u kulturi ćelija • Kultura ćelija predstavlja sistem živih ćelija koje žive, metabolišu i razmnožavaju se in vitro u specijalnim hranljivim podlogama.

  4. Uslovi za kulturu ćelija • 1.sterilnost podloga, pribora i aseptičan rad • 2.hranljive podloge medijumi su izotonični rastvori elektrolita koji sadrže razne kombinacije prirodnih i sintetskih sastojaka (serum, glikozu, esencijalne amino kiseline i vitamine, antibiotike, antimikotike i pufere zbog kontrole pH)

  5. Uslovi za kulturu ćelija • 3.Odgovarajuća atmosfera • 4.temperatura od 37°C • 5.specijalne staklene i plastične posude sa bar jednom ravnom stranom za koju se ćelije kulture mogu prilepiti a zatim nastaviti rast i razmnožavanje

  6. TKIVA • Za pripremu kultura koriste se razna tkiva:humana i animalna, embrionalna, tumorska • Od ćelija najviše se koriste fibroblasti i epitelne ćelije

  7. VRSTE KULTURA • 1.PRIMARNE KULTURE • 2.KONTINUIRANE ĆELIJSKE LINIJE • 3.DIPLOIDNE KULTURE ĆELIJA

  8. PRIMARNE KULTURE ĆELIJA • KULTURE ĆELIJA KOJE SU PRVI PUT PORASLE IN VITRO SU PRIMARNE KULTURE ĆELIJA • Mogu se dobiti od tkiva ili organa fetusa, adulta ili tumora.Sadrže različite tipovećelija , što omogućava njihovu primenu za izolovanje brojnih virusa koji pokazuju tropizam za različite ćelije. • Mogu se kultivisati još nekoliko puta a zatim propadaju

  9. PRIPREMA PRIMARNIH KULTURA ĆELIJA • MEHANIĆKI SE ISITNJAVA TKIVO • DELUJE SE PROTEOLITIČKIM ENZIMIMA (TRIPSINOM)KOJI OMOGUĆAVAJU RAZDVAJANJE POJEDINAČNIH ĆELIJA • ODSTRANJUJE SE TRIPSIN, ĆELIJE SE KONCENTRIŠU CENTRIFUGIRANJEM • ĆELIJE SE SUSPENDUJU U PODLOZI ZA RAST I RAZDELE U ODGOVARAJUĆE POSUDE • TERMOSTATIRAJU NA 37°C • Za nekoliko dana ćelije se razmnože i stvore na unutrašnjoj površini stakla jedan sloj novonamnoženih ćelija (jednoslojna kultura ćelija)

  10. NEKE PRIMARNE KULTURE ĆELIJA • BUBREŽNE ĆELIJE RHESUS MAJMUNA (Macaca mulatta) • Bubrežne ćelije zeca

  11. Kontinuirane ćelijske linije • Kontinuirane ćelijske linije sadrže samo jedan tip ćelija koje su visoko adaptirane da se razmnožavaju in vitro i mogu se neograničen broj puta pasažirati (subkultivisati)

  12. KONTINUIRANE ĆELIJSKE LINIJE • VERO poreklom od bubrega zelenih afričkih majmuna • HEP 2 poreklom od karcinoma larinksa • HeLa poreklom od humanog karcinoma grlića materice • RD ćelije poreklom od humanog embrionalnog rabdomiosarkoma • BHK-21 bubrega hrčka • MDCK BUBREŽNE ĆELIJE PSA

  13. KONTINUIRANE KULTURE ĆELIJA VERO KULTURA ĆELIJA HELA KONTINUIRANA LINIJA

  14. DIPLOIDNE ĆELIJSKE KULTURE • U pasažama održavaju originalni diploidni broj hromopzoma i rastu kao jednoslojne kulture ćelija • Mogu se in vitro subkultivisati oko 50 -100 puta • Diploidne fibroblasne ćelijske linije dobijene od embrionalnih ili fetalnih tkiva se koriste u dijagnostičke svrhe ili za atenuaciju virusa i dobijanje humanih vakcina

  15. VRSTE DIPLOIDNIH ĆELIJSKIH LINIJA • Wi-38 • MRC-5 • NISKE PASAŽE OVIH KULTURA se koriste za dobijanje virusnih vakcina MRC-5 HUMANI DIPLOIDNI FIBROBLASTI

  16. Podela kultura ćelija prema karakteru rasta • JEDNOSLOJNE KULTURE NASTAJU OD ĆELIJA KOJE IMAJU KONTAKTNU INHIBICIJU TAKO DA TOKOM RAZMNOŽAVANJA FORMIRAJU JEDAN SLOJ • VIŠESLOJNE KULTURE ĆELIJA DOBIJAJU SE OD MALIGNIH I TRANSFORMISANIH ĆELIJA KOJE NEMAJU KONTAKTNU INHIBICIJU TE U TOKU RASTA FORMIRAJU VIŠE SLOJEVA ĆELIJA

  17. Suspendovane ćelijske kulture • DOBIJAJU SE ODRŽAVANJEM ĆELIJA U SUSPENDOVANOM STANJU zahvaljujući stalnom rotiranju boca što onemogućava pripajanje ćelija za zid boce • Neki virusi se bolje razmnožavaju u suspendovanim kulturama ćelija nego u jednoslojnim

  18. Razmnožavanje virusa u kultuiri ćelija • Inokulacija virusa se vrši ubacivanjem 1-2 kapi obrađenog bolesničkog materijala u medijum koji prekriva ćelije • Inokulisane kulture se inkubiraju na 36 - 37°C • Vrednost pH podloge treba da bude 7,2-7,4

  19. CITOPATOGENI EFEKAT • Morfološke promene ćelija u kojima se razmnožava virus se nazivaju citopatogeni efekat (CPE) • Najčešće promene su: zaokrugljivanje ćelija (dobijaju oblik kugle) i njihovo baloniranje, piknoza jedra i odvajanje ćelija od podloge stvaranje mnogojedarnih džinovskih ćelija pojava citoplazmatskih i nuklearnih inkluzija citoliza

  20. Dokazivanje prisustva i razmnožavanja virusa u kulturi ćelija • 1.Inhibicija ćelijskog metabolizma • 2.Pojava hemaglutinina u medijumu kulture ćelija ili pojava antigena koji veže komplement • 3.Hemadsorpcijom na ćelije u kojima se razmnožavaju virusi • 4.Tehnikom imunofluorescencije • 5.Interferencijom (virus rubele i echo 11)

  21. IDENTIFIKACIJA UMNOŽENOG VIRUSA • SEROLOŠKIM METODAMA TESTOVIMA NEUTRALIZACIJE FLUORESCENTNOM MIKROSKOPIJOM Reakcija vezivanja komplementa Inhibicija hemaglutinacije • Za serološko dokazivanje potrebna su specifična antivirusna antitela (najbolje monoklonalna)

  22. IZOLACIJA VIRUSA U OPLOĐENOM KOKOŠIJEM JAJETU • U PRVIH 10-12 DANA TKIVA JAJETA NISU SASVIM DIFERENCIRANA PA SU PODESNA ZA INOKULACIJU • GRAĐA 1.FIBROZNA MEMBRANA (BELA OPNA) 2.HORIOALANTOISNA MEMBRANA 3.AMNIONSKA KESA 4.ŽUMANČANA KESA 5.EMBRION

  23. GRAĐA EMBRIONISANOG KOKOŠIJEG JAJETA

  24. INOKULACIJA • Do inokulacije jaje se čuva na 38°i vlažnost od 55-60% • INOKULACIJA SE VRŠI U horioalantoisnu šupljinu i na horioalantoisnu membranu amnionsku kesu žumančanu kesu embrion

  25. Inokulacija na horioalantoisnu membranu • Embrion je star 10 – 12 dana • Inkubacija u termostatu na 35 st.C u trajanju od 48 -72 sata • Herpes virusi, virusi variole i vakcinije, virusi koji izazivaju encefalitise

  26. Inokulacija u alantoisnu šupljinu • Starost embriona 9-11 dana • Inkubira se 2-5 dana u termostatu na 35st.C • Pre berbe jaje se hladi na 4st.C • Orthomyxo i paramyxo virusi

  27. Inokulacija u amnionsku vreću • Embrion star 7-12 dana • Jaje se prosvetli i inokuliše u amnionsku vreću • Inkubira se 3-5 dana na 35st.C • Pre berbe jaje se ohladi na 4st.C • Za orthomyxo i paramyxo viruse

  28. INOKULACIJA U ŽUMANČANU KESU • Embrion star oko 6 dana • Posle inokulacije • Inkubira se na 35st.C 3-9dana • Pre berbe se ohladi na 4st.C • Za hlamidije, rikecije i neurotropne viruse

  29. IZOLACIJA VIRUSA U LABORATORIJSKIM ŽIVOTINJAMA • ŽIVOTINJE KOJE SE KORISTE ZA IZOLACIJU VIRUSA

  30. INOKULACIJA U LABORATORIJSKE ŽIVOTINJE • ZAMORCI,LASICE,KUNIĆI,KOKOŠI, MAJMUNI • INOKULACIJA SE VRŠI PREMA TROPIZMU

  31. INOKULACIJA VIRUSA LABORATORIJSKIM ŽIVOTINJAMA • INTRACEREBRALNA • INTRAPERITONEALNA • INTRANAZALNA • INTRAMUSKULARNA • INTRAVENSKA

  32. POSTAVLJANJE ETIOLOŠKE DIJAGNOZE NAKON IZOLACIJE VIRUSA • OBOLELE ŽIVOTINJE SE ŽRTVUJU • TKIVO PREMA KOME INOKULISANI VIRUS IMA TROPIZAM SE IZDVAJA ,PREPARATIVNIM METODAMA DOBIJA SE ČIST VIRUS PODESAN ZA IDENTIFIKACIJU KOJA SE SPROVODI SEROLOŠKI (PRIMENOM SPECIFIČNIH ANTIVIRUSNIH ANTITELA)

  33. PREPARATIVNE METODE U VIRUSOLOGIJI • 1.FIZIČKE METODE (ultrazvuk,odmrzavanje zamrzavanje, tarionik sa tučkom, tkivni mikseri) i HEMIJSKE METODE (Al sulfat, bakar fosfat) • 2.FILTRACIJA (BAKTERIOLOŠKIM FILTRIMA pa ultrafiltrima) • 3.CENTRIFUGIRANJE (LABORATORIJSKIM CENTRIFUGAMA PA ULTRACENTRIFUGAMA) • Elektroforezom i hromatografijom u koloni

  34. INKLUZIJE • NAKUPINE VIRUSA ILI DEGENERATIVNI ILI REAKTIVNI PRODUKTI ĆELIJA NA RAZMNOŽAVANJE VIRUSA U NJIMA • VIDLJIVE SU SVETLOSNIM MIKROSKOPOM • INTRACITOPLAZMATSKE (NEGRIJEVA TELA) ILI INTRANUKLEARNE (herpes virus)

More Related