1 / 32

(1995) C. elegansi par-1 mRNAle antisense RNAd ekspresseerides blokeeriti ekspressioon.

RNAi kirjeldati esmalt (1989) taimedes kus transgeenide mitmete koopiate korraga genoomi viimine põhjustas vastava endogeense geeni post-transkriptsioonilist vaigistamist. Uurimise buum algas 1998 kui RNAi kirjeldati C. elegansis.

orrick
Download Presentation

(1995) C. elegansi par-1 mRNAle antisense RNAd ekspresseerides blokeeriti ekspressioon.

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. RNAi kirjeldati esmalt (1989) taimedes kus transgeenide mitmete koopiate korraga genoomi viimine põhjustas vastava endogeense geeni post-transkriptsioonilist vaigistamist. Uurimise buum algas 1998 kui RNAi kirjeldati C. elegansis.

  2. (1995) C. elegansi par-1 mRNAle antisense RNAd ekspresseerides blokeeriti ekspressioon. • Üllataval kombel sama lugu kui sense RNAd ekspresseeriti. • (1998) vaigistamine levib iduteede kaudu mitu generatsiooni ja samas loomas koest koesse • dsRNA palju parem vaigistamise induktor kui ssRNA

  3. RNAi päästikud • dsRNA (viirused) • ssRNA (transposonid, transgeenid)- vajab RdRP-d

  4. RNAi toimemehhanismid • Spetsiifiliste rakuliste RNAde lagundamine (siRNA, miRNA) • Spetsiifiliste rakuliste mRNAde translatsiooni inhibeerimine (miRNA) • Heterokromatiini teke ja hoidmine (miRNA)

  5. Sõnaraamat • RNAi – RNA interferents • siRNA – small interfering RNA (prekursor kaheahelaline RNA, u 22nt) • miRNA – micro-RNA (prekursor juuksenõel, u 22 nt) • shRNA – short haipin RNA (kunstlik) • rasiRNA – repeat associated short interfering RNA (endogeenne) • RISC – RNA-induced silencing complex • RITS - RNA-induced transcriptional silencing complex

  6. 1. RdRP teeb ssRNA pikaks dsRNAks Toimub taimes, C. elegansis, Neurosporas. Ei toimu kärbses ega imetajas.

  7. 2. RNaasIII-e tüüpi endonukleaas Dicer lõikab tsütoplasmas dsRNA 21-28 nt juppideks. primaarse miRNA prekursori lõikamine algab tuumas (Drosha), produkt läheb tsütoplasmasse (eksportiin 5 abil) kus Dicer miRNA valmis teeb. Mõlemad nukleaasid jätavad 5´ fosfaadi ja 2-nukleotiidise 3´-overhang-i. Reaktsiooni ATP sõltuvus segane. Kärbses 2 dicerit, Arabidopsises 4, C. elegansis, S. pombes ja imetajas 1. Erinevad dicerid võivad õra tunda erinevaid RNA tüüpe.

  8. RISC sisaldab ainult ssRNA juppi Argonaut (Ago) valku – see on endonukleaas, mis degradeerib märklaud-RNA RNA helikaasid (?) RISCi suurus 130-160 kDa (kõrge soolaga puhastatud inimesest) kuni 80S-ni (kärbse lüsaadist) RISCi assambleerimine ATP-sõltuv, märklaua lõikamine ATP-sõltumatu Ago geene – S. pombes 1, C. elegansis üle 20: ei ole redundantsed 3. RISCi assambleerimine

  9. 4. mRNA lagundamine ja translatsiooni repressioon • RISC (Ago) lõikab märklauda komplementaarse ala keskelt, ei vaja ATPd, vajab Mg++. • Et sama RISC saaks mitu korda lõigata on vaja ATPd. • miRNA translatsiooni repressioon seondumise kaudu 3´UTR-le, komplementaarsus madalam kui siRNA-de puhul tavaks.

  10. miRNA • u 22 nt • Leitud kõigis hulkrakseis kus otsitud • Taimes paarduvad mRNA märklauaga vigadeta – viivad mRNA degradatsioonile • Loomades tavaliselt puudulik paardumine – translatsiooni inhibitsioon

  11. Hea looma miRNA tunneb ära... • ... paardub märklaua 3´UTR-ga • ... Rohkem pidevat aluspaardumist leiab miRNA 5´-poolses osas • ...on fülogeneetiliselt konserveerunud

  12. Hea looma miRNA märklaua tunneb ära ... • Kui tema 3´UTRis on mitu konserveerunud järjestust miRNAga paardumiseks

  13. miRNA märklaud-mRNAd • Palju transkriptsioonifaktoreid • Kärbse miR-277: leu, ile, val katabolismi geenid • Rakuproliferatsiooni kontrollirajad

  14. RNAi ja heterokromatiini vaigistamine • 1928 Heitz – heterokromatiid on kromosoomi osa, mis jääb läbi rakutsükli kondenseerunuks • Koosneb põhiliselt kordusjärjestustest ja transposonitest (tsentromeer, telomeeri ümbrus) • Kärbses vaigistab hetrokromatiidi lähedus silmavärvi geeni – position effect variegation (PEV)

  15. Vaigistatud heterokromatiin... • ... Hoiab ära rekombinatsiooni ja sellega seoses kromosoomi ümberkorraldusi • ... Vaigistab transposoneid

  16. Heterokromatiini tekitab ... • ... Histooni H3 lys 9 metülatsioon (H3mK9) H3mK9 tunneb ära hetero-chromatin protein 1 (HP1) • ...Tsütosiini metülatsioon DNAs (puudub või p a puudub pärmis, kärbses, nematoodis) H3mK9 ja Cm on omavahel funktsionaalses seoses, mõlemad seotud RNAi mehhanismiga

  17. S. pombe • S. pombes ago-, dcr- ja rdp- tüved elavad kuid ei suuda vaigistada tsentromeersesse DNAsse pandud reportergeene • RITS puhastatud heterokromatiinist, sisaldab Ago, Chp1 (heterokromatiini valk, seob H3mK9), Tas3 (tundmatu funktsioon) • siRNA toob ka RdRP tsentromeerile

  18. Paljud RNAi-ks vajalikud geenid vajalikud ka transposonite vaigistamiseks C. elegansis, kärbses ja trüpanosoomis. • Paljud siRNAd vastavad tsentromeeri kordusjärjestustele • Arabidopsise endogeensetest siRNAdest 90-95% vastab heterokromatiini transposonitele ja kordustele. • Samas vaigistamine sageli redundantne protsess – RNAi ei ole ainuke vahend

  19. RNAi kasutamine

  20. Probleemid: • Nii siRNA kui shRNA võib vahest PKR-i aktiveerida • Kui siRNA otsa jääb 5´-trifosfaat, aktiveeritakse interferooni vastus • Suur kogus siRNAd viib vastuse spetsiifika alla

  21. dsRNA imetajas

More Related