DNA Repair

1. ซ่อมแซม DNA ที่เสียหาย ให้กลับสู่ original state DNA Repair

2. Mechanisms ของ DNA Repair I. True repair กำจัด defective DNA ทั้งหมด 1. Direct reversal mechanism หรือ Directly undoing DNA damage 2. Excision repair 3. Mismatch repair II. Non-repair method คงเหลือ defective DNA 4. Recombination repair 5. Error-prone repair system

3. 1. Direct Reversal Mechanism • การซ่อมแซมโดยกลไกย้อนกลับ หรือDirectly undoing DNA damage 1.1 Light-dependent repair / Photoreactivation 1.2 O6- methylguanine methyltransferase

4. 1.1 UV damage repair / Light repair • Pyrimidine dimer (T=T) ที่เกิดจากแสง UV ถูกทำให้แยกออกจากกันด้วย แสงสว่าง (light > 300 nm) • และ photoreactivating enzyme หรือ DNA photolyase • แสง activate enzyme ให้ตัด T=T dimer ออก • พบใน bacteria, microbial eukaryote และพืช

6. 1.2 Direct reversion ของ Methylation / Ethlyation • ซ่อมแซม DNA ที่ ถูก methylation หรือ ethylation • O6- methylguanine methyltransferaseรับ methyl หรือ ethyl group จาก Guanine บน DNA • Enzyme นี้มี sulfur atom ของ cystein เป็นตัวรับ methyl หรือ ethyl แล้ว enzyme ใช้อีกไม่ได้ เป็น suicide enzymeเป็นการซ่อมที่แพงมาก • พบในตั้งแต่ E. coliถึง human

7. O6- methylguanine methyltransferase

8. 2. Excision Repair • ซ่อมแซมโดยตัดเอา damaged DNA ออกแล้วใส่ fresh DNA segment เข้ามาแทน • Excision repair เป็น repair ที่เกิดมากที่สุด และเกิดได้หลาย mechanisms 2.1 Base excision repair 2.2 Nucleotide excision repair

9. 2.1 Base excision repair ตัด damaged base ออกก่อนโดย DNA glycosylase ได้ AP site 1) DNA glycosylase ตัด damaged baseออกที่ glycosidic bond ได้ sugar ที่ไม่มี base AP site (Apurinic หรือ Apyrimidinic sites) 2) AP endonuclease และ Phosphodiesterase ตัด sugar-phosphate group ออก 3) DNA polymerase ใส่ base ใหม่เข้าไป 4) DNA ligase เชื่อม 2 nucleotides ให้ต่อกัน

10. Abnormal base • Glycosylase ตัด base --> AP site • AP endonuclease ตัด sugar-PO4 • DNA polymeraserefills new base • DNA ligase seals nick

11. 2.2 Nucleotide excision repair • ตัด abnormal bases มากกว่า เช่น T=T dimers หรือ base ที่มี side group ขนาดใหญ่ • พบใน E. coliถึง human 1)Excision nuclease (Exonuclease) ตัด oligonucleotide (12 mers) ที่มี damaged bases ออก 2) DNA polymerase I fills gap 3) DNA ligase seals nick

12. Excision nuclease เป็นผลผลิตของ 3 genes คือ • UvrA, • UvrB และ • UvrC

13. 3. Mismatch Repair • Mismatch เกิดระหว่าง replication เมื่อ (1) ใส่ base ผิด (2) failure ของ proofreading system • จึงต้อง repair หลัง replication เช่น T = G ซึ่งจะได้ • Parental strand มี base ปกติ • Progeny strand มี mismatched base • เซลล์จะใช้แบบของ methylation ของ base ใน สาย pogeny เป็นเครื่องบอกความแตกต่างว่า T หรือ G ถูก

14. โดย A ใน GA*TC sequence จะถูก methylated ทุก 250 base pairs หลัง replication • ระหว่างที่รอ methylation บนสาย pogeny --> mismatch repair system จะใช้ภาวะการมีกับไม่มี methyl ตัด mismatched base ออกจากสาย progeny ก่อน แล้วจึง methylate • Prokaryote และ Eukaryote มี mismatch repair system คล้ายกัน

15. Mismatch repair ใน E. coliมี proteins จาก 4 genes • mutH, mutL, mutSและ mutU (= uvrD) • MutH protein มี GATC-specific endonuclease activity ตัดจาก GATC ที่ ยังไม่ methylated ด้าน 5’ หรือ 3’ ไป ~ 100 nt --> ได้ gap • DNA pol fills gap และ • DNA ligase seals nick

17. 4. Recombination Repair(Postreplicative Repair) • Repair mechanism ที่สำคัญที่สุด เพราะต้องการ DNA replication ก่อน จึง repair ได้ และ system อื่นใช้ไม่ได้ • เมื่อ DNA pol III replicate ไปถึง T=T dimer ทำให้ DNA replication หยุดชั่วคราว แลัว replication ต่อหลัง dimer ด้วย primer ใหม่ ได้ duplex

18. หลัง Replication --> 2 สาย sister - double helices Damaged double helix Sister double helix (normal) parent strand มี T=T (1) normal parental strand (3)progeny strand มี gap (2) normal progeny strand (4)

19. Recombination repair ได้เฉพาะ สาย progeny ทีมี gap • Gapped strand (2) ของ damaged duplex จะ cross กับ parent strand (3) ของ normal double duplex • ตัดเอา nucleotides จาก (3) ไปต่อใส่ gap ของ (2) • สาย T = T (1) คงอยู่ ซึ่งจะถูก repair ด้วยวิธี nucleotide • excision repair system หรือ ไม่มี repair • สาย gapped (2) สมบูรณ์ • Parent strand (3) ของ sister duplex มี gap --> filled ด้วย DNA pol I & DNA ligase --> sister duplex (3 & 4) สมบูรณ์

20. Recombination ต้องการ RecA protein จาก recA gene • RecA protein ทำหน้าที่ exchange single strand ระหว่าง homologous double helices ใน homologous recombination ปกติด้วย

21. 5. Error-prone (SOS) Repair • เมื่อเซลล์ถูกทำลายมาก ๆ จาก mutagents เช่น UV light เซลล์ต้องพยายามให้รอดชีวิต โดย SOS response • SOS response ประกอบด้วย DNA repair ทั้งหมด, recombination, สังเคราะห์ proteins ที่ใช้ใน replication • Error-prone repair • เป็น ส่วนหนึ่งของ SOS response • เป็น replication โดย DNA pol ที่ใส่ base ผิดเข้า damaged segment ของ template strand • โดยการช่วยของ 2 proteins จาก umuC & umuD (UV mutable) genes

22. DNA damage เป็นตัว induce pathway (1) mutagen เช่น UV damages DNA --> activate recA => RecA เป็น protease ซึ่งมีหลาย targets (2) RecA ย่อย LexA ซึ่ง repressor หลาย genes --> LexA หลุดจาก genes ที่ repressed อยู่ทั้งหมด เช่น umuDC operon (3) umuDC operon active --> transcription --> translation ให้ UmuD & UmuC (4) UmuD & UmuC ทำให้ DNA pol ที่หยุด ณ damaged site replication ต่อไป แต่ใส่ base ผิด เช่นใส่ GC เข้ากับ T=T และ replication ดำเนินการต่อไป

23. Error-prone repair เป็น ระบบที่ทำให้ replication ที่ damaged sites โดยใส่ base ผิด • UV activates RecA • RacA cleaves LexA • umuDC operon trnscribes • UmuC & UmuD ยอมให้ DNA replicate ใส่ bases คู่กับ T = T dimer

24. DNA Damage, Repair & Cell Function