FACOLTÀ DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE E NATURALI

1. FACOLTÀ DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE E NATURALI Corso di Laurea magistrale in Biotecnologie Genomiche ELABORATO FINALE Regolazione dell'espressione dei geni coinvolti nella biosintesi degli acidi grassi nel lievito Kluyveromyceslactis Candidato: Lorenzo De Angelis N° di matricola: 1166096 Relatore interno: Prof. Michele Maria Bianchi Anno Accademico 2013-2014

2. Acidi grassi omega-3 Gli Omega-3 (o PUFA n-3) sono una categoria di acidi grassi essenziali per l’uomo • Studi clinici dimostrano che la carenza di w3 può essere correlata all’insorgenza di patologie: • Cancro • Patologie cardiovascolari • Disturbi mentali • Sono coinvolti in vari processi biologici: • infiammazione • aggregazione delle piastrine • ipertensione • iperlipidemia

3. Acidi grassi omega-3 • Gli omega 3 esercitano le loro funzioni nella cellula attraverso diversi meccanismi: • Alterazione della composizione e della funzione della membrana cellulare • Regolazione dell’espressione genica • Produzione di eicosanoidi

4. Biosintesi degli acidi grassi • Avviene nel citosol • Il primo passaggio prevede la carbossilazione dell’acetil-CoA a malonil-CoA, uno degli intermedi della reazione insieme all’acetil-CoA • I passaggi successivi sono catalizzati dal complesso multi enzimatico acido grasso sintasi (FAS)che media l’addizione di 2 atomi di carbonio alla volta, sfruttando il potere riducente del coenzima NADPH • FAS catalizza le reazioni di condensazione dell’Acetil-CoA con il Malonil-CoA e i passaggi intermedi di riduzione, deidratazione e riduzione • 7 cicli di allungamento formano il palmitoil-ACP che viene idrolizzato a palmitato (C16:0)

5. Trasporto dell’acetil-CoA mitocondriale nel citosol • L’acetil-CoA è generato nel mitocondrio dalla decarbossilazione ossidativa del piruvato e dall’ossidazione degli acidi grassi • Il CoA non può attraversare la membrana mitocondriale , entra nel citosol attraverso il sistema di trasporto dei tricarbossilati • Il CoA entra nel citosol sottoforma di citrato e viene riconvertito in ossalacetato e acetil-CoA dalla citrato liasi con il consumo di ATP

6. Biosintesi degli acidi grassi polinsaturi • Il palmitato è il precursore di acidi grassi a catena più lunga saturi e insaturi mediante l’azione di elongasi e desaturasi • I sistemi di mammifero contengono quattro desaturasi terminali: D9, D6, D5 e D4 • S. cerevisaepossiede solamente la desaturasiD9 (Ole1) ed è in grado di produrre palmitoleato e oleato • K. lactispossiede le desaturasiD12 (Fad2) e w3 (Fad3) ed è in grado di produrre de novo acido linoleico e a-linolenico • Le cellule della maggior parte degli organismi, in risposta a un abbassamento della temperatura, modificano la composizione della membrana plasmatica aumentando il numero di insaturazioni nelle catene alifatiche degli acidi grassi incrementando l’attività delle desaturasi • In S. cerevisaee K. lactisil gene OLE1 viene attivato trascrizionalmente anche in condizioni ipossiche K. lactis Mammiferi

7. Regolazione dell’espressione del gene codificante la desaturasiD9 (OLE1) 1151 aa K. lactisKlMga2 1113 aa S. cerevisiaeMga2 • Identità di sequenza 39% ; somiglianza 54% Ipotesi sul meccanismo di attivazione di Mga2

8. Espressione dei geni ACC1, OLE1, FAD2 e FAD3 in K. lactis Norm Hypo 1h T15°C 1h Norm Hypo 1h T15°C 1h GDK Klmga2Δ GDK Klmga2Δ GDK KLmga2Δ GDK Klmga2Δ ACC1 rRNAs FAD3 FAD2 OLE1 rRNAs • ACC1 codifica per l’enzima che catalizza la carbossilazione dell’acetil-CoA in malonil-CoA nel citosol • Nel ceppo Klmga2D l’espressione dei geni ACC1 e FAD2 risulta ridotta rispetto al wt in condizioni di crescita normossica, ipossica e a 15°C • I dati sembrano confermare il coinvolgimento di Mga2 nell’espressione dei geni della via di biosintesi degli acidi grassi in risposta a condizioni di ipossia e bassa temperatura

9. Scopo della tesi Ricerca di un’eventuale correlazione tra variabili ambientali, livelli di espressione dei geni della via di biosintesi degli acidi grassi e composizione in acidi grassi in K. lactis • Valutare i livelli di espressione dei geni per le desaturasi, codificanti per D12 (Fad2) e w3 (Fad3), nel ceppo MWL9S1 wild-type e nei ceppi deleti per KlFAD2 e KlFAD3 (LDA2 e LDA3) in condizioni di: • normossia • ipossia • bassa temperatura (15°C) Analizzare la composizione in acidi grassi dei ceppi nelle tre condizioni Costruzione di ceppi mutanti in cui i geni KlOLE1, KlFAD2 e KlFAD3 sono fusi al gene reporter GFP per localizzare le desaturasi nella cellula nelle tre condizioni

10. Delezione dei geni KlFAD2 e KlFAD3 La costruzione di ceppi mutanti del lievito K. lactisdeleti per i geni KlOLE1, KlFAD2 e KlFAD3 codificanti per le desaturasi degli acidi grassi (D9, D12 e w3) è stata eseguita sul ceppo MWL9S1Dnej (mat a, ura A1, leu2, hys A1, trp1 met A1) utilizzando cassette di sostituzione ottenute tramite PCR Long flankinghomology LFH Short flankinghomology SFH I ceppi LDA2 e LDA3 sono stati ottenuti attraverso la trasformazione per elettroporazione e i trasformanti positivi, resistenti alla geneticina, sono stati confermati mediante PCR

11. Crescita in bioreattore Precoltura stock Beutacon terreno YPD 200 mL Vessel con terreno YPD 600 mL Autoclavati, montati sul bioreattore e lasciati a equilibrare overnight (T=28°C, aria= 0,4 L/min  pO2=100%) Crescita a 28°C, in agitazione overnight MWL9S1 LDA2 LDA3 Dopo due duplicazioni nel fermentatore le cellule avranno raggiunto OD600 nm≈ 2 Vengono prelevate le cellule in condizioni di normossia a 28°C Impostazione delle condizioni di crescita in ipossia/bassa temperatura Prelievo delle cellule dopo 1h e 4h Dalle cellule raccolte verrà estratto l’RNA per il successivo Northern-blot e gli acidi grassi per l’analisi cromatografica

12. Analisi dell’espressione genica di KlOLE1 • L’espressione di KlOLE1 sembra aumentare dopo la prima ora di ipossia in tutti e tre i ceppi considerati, dopo 4 ore si assiste ad un ulteriore incremento dell’induzione nei ceppi MWL9S1 wt e LDA3 • Nel ceppo LDA2 si assiste ad una forte diminuzione del trascritto di KlOLE1 dopo 4 ore di ipossia. In questa condizione si assiste parallelamente all’assenza delle subunità maggiori degli rRNA • In tutti e tre i ceppi l’andamento dell’espressione a bassa temperatura è identico: presenta una leggera induzione dopo un’ora a 15°C per poi ristabilirsi a livelli normali dopo 4 ore • L’espressione di KlOLE1 non risulta influenzata dalle delezioni dei geni KlOLE1mRNA rel. expr. 9S1 N 9S1 H 1h 9S1 15 1h 9S1 H 4h 9S1 15 4h LDA2 N LDA2 H 1h LDA2 15 1h LDA2 H 4h LDA2 15 4h LDA3 N LDA3 H 1h LDA3 15 1h LDA3 h 4h LDA3 15 4h OLE1

13. Analisi dell’espressione genica di KlFAD2 • La totale assenza del trascritto di KlFAD2 conferma ulteriormente la sua delezione • Nel ceppo wt i livelli di trascritto di KlFAD2 risultano più che raddoppiati solamente dopo 4 ore di ipossia • In LDA3 l’induzione è graduale, aumenta fino a raddoppiare dopo 4 ore • L’effetto del cambiamento di temperatura sull’espressione di KlFAD2 sembra essere lo stesso di KlOLE1 sia in MWL9S1wt che in LDA3: c’è un modesto aumento di trascritto dopo 1 ora a 15°C rispetto alle cellule cresciute a 28°C, il livello si ristabilisce ai livelli iniziali dopo 4 ore KlFAD2mRNA rel. expr. 9S1 N 9S1 H 1h 9S1 15 1h 9S1 H 4h 9S1 15 4h LDA2 N LDA2 H 1h LDA2 15 1h LDA2 H 4h LDA2 15 4h LDA3 N LDA3 H 1h LDA3 15 1h LDA3 h 4h LDA3 15 4h FAD2

14. Analisi dell’espressione genica di KlFAD3 • Nel ceppo MWL9S1 wt il livello di espressione di KlFAD3 dimezza dopo 1 ora di ipossia per poi ristabilirsi allo stesso livello del ceppo normossico dopo 4 ore • In LDA2 normossico il livello è più alto rispetto al wt. Dopo 1 ora e 4 ore di ipossia il livello del trascritto risulta significativamente ridotto • Dopo 1 ora a 15°C la quantità di trascritto risulta maggiore nel ceppo wt, rispetto alle cellule cresciute a 28°C, dopo 4 ore il livello decresce • La trascrizione di KlLDA3 in LDA2 sottoposto allo shift di temperatura segue lo stesso andamento descritto nel punto precedente, tuttavia la quantità di trascritto di partenza è maggiore e dopo 1 ora raddoppia KlFAD3mRNA rel. expr. 9S1 N 9S1 H 1h 9S1 15 1h 9S1 H 4h 9S1 15 4h LDA2 N LDA2 H 1h LDA2 15 1h LDA2 H 4h LDA2 15 4h LDA3 N LDA3 H 1h LDA3 15 1h LDA3 h 4h LDA3 15 4h FAD3

15. Composizione in acidi grassi • L’unica variazione significativa di acidi grassi totali avviene nel ceppo MWL9S1 wt dopo quattro ore di crescita a 15°C • Nei tre ceppi non si assiste a variazioni significative dell’SI in risposta alle condizioni di ipossia e bassa temperatura nei tempi considerati • La delezione di KlFAD2 provoca una drastica riduzione del SI rispetto al wt in tutte le condizioni dovuta all’incapacità di produrre linoleato e acido a-linolenico • I valori di SI in LDA3 sono confrontabili con quelli wt, nonostante sia attiva solo la desaturasi Fad2

16. Composizione in acidi grassi a 28°C e 15°C • L’abbassamento della temperatura, nei tempi considerati, non sembra determinare variazioni significative della composizione in acidi grassi in tutti e tre i ceppi • L’acido grasso più rappresentato nel ceppo wt e in LDA3 in tutte le condizioni considerate è l’acido linoleico (C18:2), prodotto dalla desaturasi Fad2 (D12) • In LDA2 risulta evidente l’accumulo di oleato (C18:1) e un lieve incremento dell’acido palmitoleico (C16:1) con il procedere della crescita a bassa temperatura • Il ceppo LDA3 risponde all’incapacità di produrre acido a-linolenico (C18:3) incrementando la produzione di acido linoleico in tutte le condizioni

17. Composizione in acidi grassi in normossia e ipossia • La condizione di ipossia, nei tempi considerati, non determina variazioni significative della composizione in acidi grassi nei tre ceppi • L’acido grasso più rappresentato nel ceppo wt e in LDA3 rimane l’acido linoleico (C18:2) in tutte e tre le condizioni • In LDA2 sia in ipossia che in normossia vi è un accumulo dell’acido oleico per compensare la mancanza degli acidi grassi prodotti da Fad2 (gene deleto) e Fad3 (non attivo) • Allo stesso modo LDA3 presenta un livello maggiore di linoleato per rispondere all’assenza di w3 provocata dalla delezione

18. Costruzione di ceppi taggati con la GFP Y X • L’introduzione del DNA in un punto specifico del genoma è stata effettuata sfruttando una strategia basata sulla PCR, come per il processo di delezione • La cassetta di inserzione viene amplificata a partire dal plasmide pYM27 e contiene: estremità omologhe alla porzione C-terminale del gene da taggare, il gene per la GFP e un marker di selezione, che nel nostro caso è il gene per la resistenza alla geneticina • La trasformazione per elettroporazione ha generato tre nuovi ceppi in cui le desaturasi sono fuse con la GFP: LDOG (OLE1::GFP), LD2G (FAD2::GFP) e LD3G (FAD3::GFP). pYM27

19. Localizzazione della desaturasiD9 KlOle1::GFP DAPI 0,2 mm IPOSSIA 15 min • IPOSSIA 1 h • La proteina KlOle1::GFP è localizzata a livello del reticolo endoplasmatico perinucleare e corticale • non si nota un cambiamento di posizione di tutte le desaturasi dopo 15 minuti e un’ora di ipossia rispetto ai ceppi normmossici • La colorazione DAPI, specifica per il DNA, conferma il posizionamento nel reticolo perinucleare escludendo la presenza della desaturasi nel vacuolo

20. Localizzazione della desaturasiD12 KlFad2::GFP DAPI IPOSSIA 15 min • IPOSSIA 1 h • KlFad2::GFP è localizzata nel reticolo endoplasmatico perinucleare e corticale come D9 • Come nel caso precedente la posizione della desaturasi non varia in risposta allo stress ipossico • La colorazione DAPI specifica per il DNA conferma la localizzazione nel reticolo perinucleare e corticale e esclude la presenza di D12 nel vacuolo

21. Localizzazione della desaturasiw3 KlFad3::GFP FM4-64 • IPOSSIA 1 h IPOSSIA 15 min • KlFad3::GFP è presente sia nel reticolo perinucleare, sia con degli “spot” nel reticolo endoplasmatico corticale • La colorazione FM4-64 ne esclude la collocazione all’interno del vacuolo • Le pareti vacuolari sono colorate in arancione e al loro interno non vie è traccia della GFP

22. Conclusione • I livelli di espressione di KlOLE1 e KlFAD2 aumentano in ipossia in tutti i ceppi considerati • KlFAD3 non sembra rispondere all’ipossia allo stesso modo, il suo livello di espressione cala in risposta a questo stimolo nel ceppo wt e in LDA2 • La bassa temperatura provoca un transiente incremento del trascritto, di tutti e tre i geni, che poi si ristabilisce a livelli normali • L’ipossia e le basse temperature non sembrano determinare variazioni significative della composizione in acidi grassi nei tempi considerati • Nei ceppi deleti vi è un accumulo dell’acido grasso a monte rispetto a quello prodotto dalla desaturasi assente • LDA2 presenta un abbassamento del livello di insaturazione totale in tutte le condizioni, non riuscendo a compensare il numero di insaturazioni normale con il solo oleato • La localizzazione delle desaturasi con domini trans-membrana, associate al reticolo endoplasmatico liscio è stata confermata dagli esperimenti al microscopio a fluorescenza • Le desaturasi non cambiano la loro posizione in risposta a condizioni ipossiche, dopo 15 minuti e un’ora, in tutti i ceppi considerati

23. Sviluppi futuri • Caratterizzazione fenotipica dei ceppi deleti LDA2 e LDA3 • Quantificazione delle desaturasi nei ceppi wt e deleti • Valutazione dei cambiamenti della composizione in acidi grassi dopo tempi prolungati di ipossia e bassa temperatura (>4h)

24. Ringraziamenti Laboratorio 13: Prof. Michele Bianchi Dott.ssa Daniela Ottaviano Andrea Visca Laboratorio 18: Dott.ssa Teresa Rinaldi Laboratorio Reverberi-Fanelli (Dip. Biologia Ambientale):Dott. Cristiano Bello GRAZIE DELL’ATTENZIONE